第二代测序技术在一中国先天性白内障家系致病基因检测中的应用

背景 某些遗传性疾病具有高度遗传异质性,因此传统的Sanger测序技术已经不能满足医学研究及临床工作的需求.第二代测序（NGS）技术由于具有费用低及检测速度快的优点而得到广泛应用,但在先天性眼病突变基因的检测中的应用效果有待验证.目的 探讨NGS技术对先天性白内障患者进行致病基因诊断和产前诊断的可行性.方法 于2013年1月收集来自河南省洛阳市的一汉族先天性白内障家系,抽取家系中3例患者（Ⅱ2、Ⅲ3、Ⅲ4）和3名表型正常者（Ⅱ3、Ⅲ1、Ⅲ2）的外周血各2 ml,EDTA抗凝,在河南省医学遗传研究所应用NGS技术对先证者进行基因突变位点检测,并采用Sanger测序技术对NGS结果进行验证,然后用Sanger测序技术对该家系其他成员的外周血样本进行突变位点的序列分析,根据确定的致病突变位点对先证者的胎儿进行产前诊断.本研究遵循赫尔辛基宣言,检测方案经河南省人民医院医学伦理委员会批准,所有研究对象均签署知情同意书.结果 该家系4代14位成员中共5例患者,其中男2例,女3例,分布于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ代中,其他家系成员表型正常,符合常染色体显性遗传方式.NGS检测发现先证者Ⅲ3CRYBB1基因第6外显子上存在c.682T＞C（p.S228P）杂合突变,Sanger法验证了该点突变.Sanger法检测发现家系中患者均存在CRYBB1基因c.682 T＞C突变,而家系中表型正常者CRYBB1基因的c.682位点基因型为T/T野生型.产前诊断结果显示胎儿（Ⅳ1）CRYBB1基因c.682位点基因型为T/T野生型.结论 NGS可用于先天性白内障基因突变的快速检测,该家系致病性基因为CRYBB1基因c.682T＞C突变,应用NGS技术结合一代测序技术成功对先证者进行了产前诊断.

生殖细胞特异表达蛋白SP3111在受精及早期胚胎发育中的作用

目的:采用抗SP3111抗体Ab2438封闭后的体外受精试验,研究SP3111蛋白在受精及早期胚胎发育过程中的作用。方法:首先在体外受精前,将精子分为3组:实验组、空白对照组、阴性对照组。实验组精子与Ab2438共同孵育1h后进行体外受精,观察2、4、6、8、22h的受精率及碎裂胚胎的发生率。接着将Ab2438作用于受精后的卵母细胞,观察作用22h后的受精率及碎裂胚胎的发生率。结果:抗体Ab2438作用小鼠精子后,碎裂胚胎发生率在加入精子后2、4、6、8、22h分别为5.26%、8.77%、23.25%、43.42%、59.21%,与各对照组碎裂胚胎形成率均有显著性差异(P<0.01)。Ab2438作用于受精后的卵母细胞,22h后实验组的正常胚胎及碎裂胚胎的形成率分别为23.64%和63.64%,与各对照组相比差异有显著性(P<0.01)。结论:抗SP3111抗体对小鼠受精及早期胚胎发育有明显的影响,因此SP3111蛋白可能是一个信号分子,与其他蛋白一起在受精和早期胚胎发育中发挥作用,对SP3111蛋白生殖功能的进一步研究将为不育的分子机制的研究提供新的思路。

转基因RNA干扰动物研究进展

RNA干扰现象自从被发现以来,广泛应用于基因功能方面的研究。应用转基因技术,将表达shRNA的"表达元件"整合到动物基因组中,产生转基因RNA干扰动物,该动物模型体内将不同程度地减少甚至缺失目的基因的表达,为基因功能研究、疾病模型构建以及基因治疗提供了新的平台。本文综述了构建转基因RNA干扰动物的方法,构建条件转基因RNA干扰动物的载体系统以及转基因RNA干扰动物的应用前景。

应用化学发光法检测男性不育人群精液活性氧水平

目的探讨化学发光法检测男性不育人群中精液ROS水平的意义。方法使用化学发光法检测1018例不育男性和50例已育志愿者精液活性氧水平。不育男性精液分为弱精子组(400例)、少精子组(19例)、少弱精子组(212例),少弱畸精子组(35例),精液指标正常组(352例)。结果男性不育人群精液活性氧水平呈偏峰分布,中位数为40 RLU/s;男性不育各组与志愿者ROS水平差异有统计学意义,不育组各组之间差异也有统计学意义。结论用化学发光法检测精液ROS水平能够较好地评价男性生育功能, ROS能够作为一个独立的指标指导男性不育的诊断。

一个发作性运动诱发性肌张力障碍家系的PRRT2基因突变研究

目的确定一个中国汉族发作性运动诱发性肌张力障碍（paroxysmal kinesigenic dyskinesia，PKD）家系中富脯氨酸跨膜蛋白2（proline—richtransmembrane protein，PRRT2）基因的突变情况。方法收集该家系患者及正常者的外周血，PCR扩增PRRT2基因的外显子及外显子与内含子连接区，PCR产物直接正反向测序并与数据库进行比对，确定有无PRRT2基因突变以及突变的位点。结果在该家系患者中均检测出了PRR222基因C．649dupC的移码突变。该突变可导致终止密码子的提前形成，使PRRT2蛋白发生截短，经查阅人类基因突变数据库证实该突变与PKD相关。家系中表型正常人未检测到该突变。结论PRRT2基因c．649dupC移码突变可能是该发作性运动诱发性肌张力障碍家系的致病原因，通过基因诊断和产前诊断可以有效阻止致病基因的侍谱。降低生育患儿的风险。

Alport综合征一家系基因分析及胚胎植入前遗传学诊断

目的 分析一个Alport综合征家系的基因突变，并对先证者的体外受精胚胎进行胚胎植入前遗传学诊断。方法 采用高通量测序技术对家系成员的COL4A3、COL4A4和 COL4A5基因进行检测。应用比较基因组杂交技术进行胚胎植入前遗传学诊断。结果 测序结果显示家系先证者及其他患者的COL4A5基因存在c.2605G 〉A（p.G869R）点突变，COL4A3和 COL4A4基因均未检测到突变。经查阅数据库，COL4A5基因的c.2605G 〉A错义突变与X连锁显性遗传Alport综合征相关。在先证者的3个体外受精胚胎中，有2个胚胎为男性，1个胚胎为女性。其中1个男性胚胎（C1）染色体拷贝数发生了变异，为45，XY，-16。另1个男性胚胎（C2）染色体拷贝数正常。选择该健康男性胚胎植入，移植后于孕20周羊膜腔穿刺术产前诊断证实为健康胎儿。结论 明确COL4A5基因的c.2605G 〉A错义突变为该 Alport综合征家系的致病原因。高通量测序技术可作为诊断Alport综合征的一种快速有效的基因检测方法。在先证者明确的前提下可用比较基因组杂交技术进行胚胎植入前遗传学诊断。

孕妇外周血胎儿游离DNA在产前筛查胎儿染色体非整倍体疾病中的价值

目的探讨孕妇外周血胎儿游离DNA在产前筛查胎儿染色体非整倍体疾病中的临床应用价值。方法接受产前诊断孕12~26周孕妇4 300例,采集外周血提取胎儿游离DNA,应用高通量测序技术检测风险值,对检测结果提示高风险者进一步行羊水穿刺胎儿染色体核型分析及基因芯片检测,对检测结果提示低风险者电话随访至分娩。结果胎儿游离DNA高通量测序检测提示高风险者45例,其中21-三体综合征29例,18-三体综合征11例,13-三体综合征5例;1例13-三体综合征羊水穿刺胎儿染色体核型分析未见异常,基因芯片检测发现孕妇13号染色体存在微重复,余44例高风险妊娠均经羊水穿刺胎儿染色体核型分析证实;胎儿游离DNA高通量测序提示低风险4 255例,其中3 008例完成随访,新生儿未见明显异常。结论孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查可高效、准确筛查胎儿染色体非整倍体疾病,且较介入性产前诊断易接受,具有较好的临床应用价值。

人类微小RNA-409-3p靶基因预测及生物信息学分析

目的采用生物信息学技术预测人类微小RNA-409-3p(hsa-miR-409-3p)靶基因,并分析其可能参与的生物学过程及信号通路。方法应用miRbase数据库和UCSC Genome Browser分析工具获取hsa-miR-409-3p的染色体定位、碱基序列和物种保守性等基本信息,利用miRanda、miRDB、Target Scan和miRwalk进行靶基因预测,采用miRwalk网站对靶基因取交集,合并有文献支持和经实验证实的靶基因作为基因集,对基因集进行功能富集分析(GO分析)和信号通路分析。结果hsa-miR-409-3p序列在各物种间高度保守。对miRanda、miRDB、Target Scan和miRwalk预测的靶基因进行交集后共得到273个靶基因。miRwalk中检索到经验证的靶基因有133个。合并后进行GO分析,结果显示靶基因富集于细胞粘附、细胞基质粘附、生长调节、调节干细胞群维持、学习或记忆、突触传递的负调节等(P<0.05)。信号通路分析结果显示靶基因富集于PI3K-Akt信号通路、Hippo信号通路、AMPK信号通路、神经营养蛋白信号通路、B细胞受体信号通路、安非他明成瘾等(P<0.05)。结论 hsa-miR-409-3p参与神经系统功能及其调节的生物学过程,与神经系统疾病的发生密切相关。

高通量测序技术在遗传性白内障诊断中的应用研究

目的探讨高通量测序技术在遗传性白内障诊断中的应用价值。方法提取先证者(34岁先天性白内障孕妇)及其家系18例家庭成员外周血全基因组DNA,采用高通量测序法筛查先证者可疑致病突变位点,采用Sanger测序方法验证先证者及其他家庭成员的可疑致病位点,在先证者孕16周时进行羊水穿刺,提取胎儿DNA并采用Sanger测序法进行验证。结果先证者和家系另10例患者均存在GJA3基因(NM021954.3)c.176 C>T位点错义杂合突变,8例表型正常的家系成员和胎儿均未检测到该位点突变。结论 GJA3基因c.176 C>T位点错义杂合突变为该家系致病基因突变,该突变位点具有致病性;高通量测序结合Sanger测序技术是一种成本相对较低、速度较快、结果可靠的分子诊断方法,可应用到先天性白内障的诊断及家庭成员的生育指导。

美国临床基因检测后遗传咨询的原则与实践

临床基因检测后的结果需告知受检方。为确保受检方能够正确领悟检测结果的意义,检测后的遗传咨询必不可少。咨询的方式、对象、执行者和内容因受检者的情况、检测的项目以及结果而异,但遗传咨询的伦理原则和实践宗旨不变。在美国,遗传咨询行业已经成熟。本文将介绍美国临床基因检测后遗传咨询的宗旨并详细解析其在各种情况下的应用,以期为中国遗传咨询行业的规范化发展提供启示。

一个Wiskott-Aldrich综合征家系融S基因的突变分析

目的探讨1个汉族Wiskott-Aldrich综合征（Wiskott-Aldrich syndrome）家系WAS基因的突变情况。 方法PCR扩增WAS基因的外显子及外显子与内含子的连接区域，对PCR产物直接进行正、反向测序并与数据库进行比对，确定有无WAS基因突变以及突变的位点。测定家系成员B细胞活化因子（B-cell activating factor, BAFF）的水平。结果家系中2例患者均携带WAS基因第2外显子c.257G〉A的半合子突变，先证者的母亲为c.257G〉A的杂合突变携带者，其他表型正常家系成员均未检测到该突变，经查阅人类基因突变数据库证实该突变为已知致病突变。家系中患者血清BAFF水平明显高于表型正常的成员。结论WAS基因c.257G〉A的突变可能是该Wiskott-Aldrich综合征家系的致病原因。

一例9q34.3微缺失综合征患儿的临床及遗传学分析

目的明确1例智力低下、发育迟缓的患儿染色体拷贝数变异的性质及来源，分析其与表型的相关性。方法采用常规G显带分析患儿及其父母的外周血染色体核型，并用微阵列比较基因组杂交（array comparative genomic hybridization，aCGH）技术进行检测。结果患儿及其父母核型未见异常，aCGH检测结果显示患儿染色体9q34．3区存在405kb的杂合缺失，该区域包含EHMT1基因和部分CACNAlB基因，其父母则未携带染色体微重复／微缺失。结论患儿染色体9q34．3区的杂合缺失为新发突变，可能是患儿患病的原因。EHMTl可能是9q34．3微缺失综合征关键基因之一。

1例1p36微缺失综合征的产前诊断及遗传学分析

目的明确1例胎儿染色体拷贝数目变异的性质,探讨其发生机制。方法高龄孕妇1例,行羊膜腔穿刺术抽取胎儿羊水,并采集孕妇及配偶静脉血,采用常规G显带分析羊水细胞及外周血染色体核型,利用微阵列比较基因组杂交(array comparative genomic hybridization,aCGH)技术分析胎儿及其父母基因组DNA拷贝数目变异,使用RepeatMasker软件分析断裂点区域序列特征,并与美国加州大学圣塔克鲁兹分校基因组数据库进行比较。结果 G显带核型分析结果显示,胎儿及其父母染色体核型未见异常;aCGH分析结果显示胎儿1p36.33-36.32区域存在2.8 Mb杂合性缺失,且包含4个功能基因,其父母基因组DNA未见拷贝数目异常;断裂点区域序列分析结果显示,断裂点区域序列GC含量升高,含有7个富含GC的短串联重复序列,包含12种Alu重复单位共32个Alu序列。结论胎儿1p36区域缺失为新发突变,具有致病性,可能与富含GC的短串联重复序列参与缺失的形成有关。

一例6q27微缺失的产前诊断及遗传学分析

目的明确1例侧脑室增宽胎儿染色体拷贝数变异的性质及来源，分析其预后及发生机制。方法常规G显带分析胎儿羊水细胞及其父母的外周血染色体核型，应用微阵列比较基因组杂交（arraycomparative genomic hybridization，aCGH）技术对胎儿及其父母进行检测。结果G显带分析胎儿及其父母染色体核型未见异常。aCGH检测显示胎儿染色体6q27区存在2．04Mb杂合性缺失，其父母未检测到染色体微重复／微缺失。6q27区包含多个与脑部发育相关的基因。染色体断裂点附近包含2410bp的回文序列，能够形成稳定的二级结构。结论胎儿携带染色体6q27区的微缺失，属于新发突变，具有致病性，与脑部结构的发育异常相关。染色体断裂点附近的回文序列可能参与了上述微缺失的形成。