PRV感染PK-15细胞对prv-miR-LLT11a表达时相的影响

为研究伪狂犬病病毒(PRV)的致病机制,将PRV QBA株按0.5个感染复数(MOI)的剂量接种PK-15细胞,分别在感染后0、1、2、4、6、8、12、24 h收取细胞并提取microRNA(miRNA),采用茎环引物实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测prv-miR-LLT11a的表达时相。RT-q PCR扩增结果显示,熔解曲线峰值单一,扩增曲线拐点清晰。RT-q PCR检测结果表明,PRV QBA株感染PK-15细胞1 h后,prv-miR-LLT11a表达量极显著升高,随后表达量下调,在感染6 h后表达量降至最低,感染8 h后表达量持续急剧升高。

副猪嗜血杆菌河南流行株的分离鉴定及分型

为了解河南省副猪嗜血杆菌病的流行情况,对2017—2018年采自河南省不同地区的45份疑似病料,进行细菌分离及形态学观察、培养特征鉴定、PCR鉴定及分型。结果显示,共分离鉴定出12株副猪嗜血杆菌,血清型为1、2、4、5、7、13型和不可分型。其中,血清型1型2株,分别命名为XX-3、HB-1;血清型2型1株,命名为XX-4;血清型4型1株,命名为ZJ-1;血清型5型4株,分别命名为LY-1、DF-1、XX-2、KF-1;血清型7型2株,分别命名为SQ-2、XX-1;血清型13型1株,命名为NY-1;还有1株不可分型,命名为SQ-1。可见,河南省存在多个副猪嗜血杆菌血清型,且不同地区血清型不一致,1、5、7型为优势血清型。

猪白细胞介素18基因的克隆及真核表达重组质粒的构建

为获得表达猪白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)的真核表达重组质粒,试验通过RT-PCR从猪脾脏、肺脏和淋巴结组织中扩增猪IL-18全基因并定向克隆到真核表达载体pZJ-1,测序分析和酶切鉴定正确后,转染至293T细胞中,并通过实时荧光定量PCR和Western blotting分别在基因和蛋白水平检测IL-18的表达。结果表明,试验成功构建了真核表达重组质粒pZJ-IL-18,且可以在293T细胞中表达IL-18基因。Western blotting试验证实,猪IL-18多克隆抗体能与约17ku的表达产物发生特异性反应,表明IL-18能正确表达且具有反应原性。本试验构建了表达猪IL-18基因的真核表达质粒,并在293T细胞中瞬时表达,为进一步研究IL-18的功能奠定基础。

河南省2016-2017年致病性猪圆环病毒遗传演化分析

采集了2016—2017年间不同地区临床疑似圆环病毒病病例样本65份，提取病毒核酸后，分别用PCV2和PCV3特异性引物进行PCR扩增，鉴定出PCV2阳性样品43份，阳性率为66．15％；PCV3阳性样品3份，阳性率为4．61％。选取其中13份PCV2阳性样品和3份PCV3阳性样品进行ORF2基因克隆、测序和进化分析。结果显示：河南省PCV2和PCV3流行毒株ORF2基因序列主要存在是单个碱基突变，没有缺失或插入。进化树分析显示，PCV2流行毒株均处于2b和2d2个基因群，其中7份属于2b型，6份属于2d型，2016年和2017年PCV2基因型并没有明显差别；3份PCV3阳性样品中KF-PCV3、AY—PCV3处于一个分支，SX-PCV3与MF589108形成一个分支。结果表明：2016—2017年间河南省感染和流行的PCV2主要为2b和2d2个基因群，表现出遗传进化稳定性，部分地区出现PCV3感染的情况。

河南省2014-2015年猪流行性腹泻病毒流行株遗传进化分析

为监测和探究河南省猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行株变异情况,本试验对15株2014-2015年间河南省PEDV流行株S基因进行克隆及全序列测定,与河南省2011-2013年流行株以及国内、外代表毒株进行同源性及遗传变异分析,并对这些毒株S基因的N-糖基化位点及跨膜螺旋区域进行预测。结果表明:本试验得到的15株毒株之间S基因核苷酸同源性为97.0%~99.8%,氨基酸同源性为97.0%~99.5%;与2011-2013年河南流行株核苷酸同源性为97.1%~99.0%,氨基酸同源性为97.2%~98.8%,与其他地区流行毒株核苷酸同源性为92.2%~99.0%,氨基酸同源性为91.9%~99.0%;与经典毒株相比,S1区域N端存在15bp的插入和6bp的缺失,核苷酸同源性为91.7%~93.6%,氨基酸同源性为92.0%~93.6%。系统发育建树结果显示目前的流行毒株与经典毒株处于不同的2个群,流行毒株分处不同亚群。对N-糖基化位点及跨膜螺旋区域的预测得知2014-2015年河南省PEDV与经典株相比出现变异,与2010年暴发时相比存在部分突变,毒株之间存在部分差异,研制出有效的针对流行毒的疫苗依然是目前防控该病的重中之重。

急性感染期猪伪狂犬病病毒部分基因组染色质状态

为探究急性感染期猪伪狂犬病病毒(PRV)在宿主细胞内基因组染色质的状态,首先建立PRV实时荧光定量PCR(qPCR)方法并测定0.1 MOI PRV感染Neuro-2a细胞后病毒基因组的复制动态,然后收集PRV感染Neuro-2a细胞的样品进行染色质免疫共沉淀试验(CHIP),并通过qPCR测定病毒部分DNA与组蛋白H3结合形成的染色质状态。结果显示,PRV急性感染Neuro-2a细胞后,部分基因组以染色质结构存在,并与病毒复制有一定相关性。本研究成功建立用于研究PRV基因组染色质状态的CHIP试验方法,为PRV急性感染期表观遗传学研究提供依据。

共表达PCV2 Cap蛋白和IL-2重组变异株伪狂犬病病毒构建及对小鼠的免疫原性

为获得有效预防猪圆环病毒2型(PCV2)及伪狂犬病(PR)感染的重组活载体疫苗,利用同源重组将PCV2 YY株ORF2和细胞因子佐剂IL-2基因插入rPRV-gE^(-)/TK^(-)/EGFP^(+)缺失的TK基因位点,获得重组病毒rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)。将重组病毒rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)及对照rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)、PCV亚单位疫苗、PR活疫苗和DMEM培养液分别免疫小鼠,4周后加强免疫1次,利用PCV2间接ELISA试验、PRV血清中和试验、T淋巴细胞转化试验和细胞亚群及因子测定等评价重组病毒rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)的免疫原性。结果显示,构建的rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)可在BHK-21细胞内表达,免疫鼠产生抗PCV2和PRV的特异性中和抗体,能刺激CD3^(+)、CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞的增殖及促使IFN-γ、IL-4和IL-12细胞因子的表达水平明显升高。结果表明,成功构建的rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)能有效诱导机体产生较高水平的免疫效果,IL-2起到免疫增强作用,可作为预防猪PR和PCV感染相关疾病的候选疫苗株。

猪ISG15基因的克隆表达与多克隆抗体的制备

本研究从家猪外周血淋巴细胞中提取总RNA,通过RT-PCR克隆出家猪ISG 15基因,经测序和序列分析,将ISG 15片段与p ET28a质粒连接,构建重组原核表达载体p ET28a-ISG15;经IPTG诱导表达后,通过Ni柱纯化,以获得ISG15蛋白。用纯化的ISG15蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。结果显示,家猪ISG 15基因CD S区长504 bp,编码167个氨基酸,包括两个泛素样结构域(N端第3~75位和C端第81~156位氨基酸肽段)及C末端保守序列为LRLRGG;W estern-blot分析表明重组ISG15蛋白的免疫原性良好;经ELISA测定血清中抗体的效价为1∶102 400。上述研究结果为进一步揭示家猪ISG15蛋白的功能奠定了基础。