丹参Sm14-3-3蛋白基因克隆、诱导模式及原核表达分析

14-3-3蛋白是植物体内一类重要的调控蛋白,对植物的生长发育及生物和非生物胁迫都具有重要的调控作用。该研究利用酵母双杂交从药用植物丹参cDNA文库中筛选并克隆到1个编码14-3-3蛋白基因(GenBank登录号为OM683281),该基因开放阅读框(ORF)由780 bp组成,编码259个氨基酸。生物信息学分析预测该蛋白的分子式为C_(1287)H_(2046)N_(346)O_(422)S_(9),相对分子质量29.4 kDa,不含信号肽,为非跨膜蛋白。通过基因同源序列比对及进化树分析,证明该基因确实属于14-3-3蛋白家族,与拟南芥、水稻中的14-3-3蛋白基因家族亲缘关系较近。将丹参14-3-3基因构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,在大肠杆菌BL21中,成功表达出重组蛋白。实时荧光定量PCR检测,确定该基因在丹参根、茎、叶、花不同组织部位中表达,叶中表达量最高,茎中次之,花中的表达量最低。15%PEG模拟干旱、植物激素水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯利诱导丹参植株,14-3-3基因表达水平在诱导的早期出现峰值,表明该基因能够快速响应干旱等非生物胁迫和水杨酸、茉莉酸、乙烯等植物激素处理。为后续研究14-3-3蛋白调控丹参酮生物合成及响应生物和非生物胁迫的分子机制奠定基础。

丹参小分子热激蛋白SmHSP21.8基因克隆、诱导模式和原核表达

为揭示小分子热激蛋白在丹参抵御逆境胁迫和有效成分积累的分子机制,根据橙根丹参转录组测序结果并结合RT-PCR技术在丹参中克隆获得一个小分子热激蛋白基因,其开放阅读框长度为585 bp,编码194个氨基酸,根据该基因编码的蛋白分子质量命名为SmHSP21.8。根据氨基酸多重序列比对和系统进化树分析,SmHSP21.8属于小分子热激蛋白的内质网亚族,并含有内质网小分子热激蛋白N端保守基序DPFR-I/V-LE-H/Q-x-P。构建原核表达载体pMAL-c2X-SmHSP21.8,并转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,经诱导,成功表达出目的蛋白。时空表达分析表明,该基因在花中表达量最高,有显著的组织特异性。经38℃、PEG6000、脱落酸(abscisic acid,ABA)和吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)的诱导,该基因的相对表达量均有提高,表明SmHSP21.8参与了丹参幼苗对非生物胁迫高温、干旱,以及外源激素ABA和IAA响应的过程,为进一步研究小分子热激蛋白参与丹参响应逆境的分子机制奠定了基础。

基于UPLC-QTOF-MS/MS和TCMIP的续断治疗类风湿性关节炎活性成分筛选及作用机制分析

目的:依托超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法(UPLC-QTOF-MS/MS)和中医药整合药理学研究平台(TCMIP),探讨续断治疗类风湿性关节炎(RA)的主要活性成分和作用机制。方法:采用UPLC-QTOF-MS/MS,分别在正、负离子扫描模式下对续断醇提液中的化学成分进行定性分析,流动相0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱(0~10 min,0.2%~20%B;10~20 min,20%~40%B;20~25 min,40%~50%B;25~33 min,50%~98%B;33~35 min,98%~0.2%B),电喷雾电离源(ESI),扫描范围m/z 50~2 000;基于TCMIP,分别获取续断、肝肾阴虚证和RA的候选靶标群,进行"病-证-方"关联分析,富集得到主要药效成分及关键作用靶标,进一步进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络及生物功能富集分析。结果:在正、负离子模式下共鉴定了续断醇提液中81个化学成分;利用TCMIP收集到这些化学成分对应的283个候选靶标,RA对应的7个疾病基因,以及肝肾阴虚证相关的215个基因。经"病-证-方"关联分析及网络拓扑特征值计算等方式最终确定了17个关键活性成分,主要为续断皂苷类、脂肪酸类成分;其主要涉及7个核心靶标,即肿瘤坏死因子(TNF),核转录因子-κB亚单位1(NF-κB1),肝细胞核因子4α(HNF4A),核受体亚家族3C组成员1(NR3C1),过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG),核受体亚家族1H组成员4(NR1H4)和核受体辅激活因子1(NCOA1),均与炎症相关,其中还有2个与胆汁酸途径相关;涉及的RA相关通路主要为PPARα激活基因表达等炎症通路,以及胆汁酸合成和代谢相关通路。结论:液质联用技术联合中医药大数据平台初步阐明了续断多成分对多条炎症通路和胆汁酸相关通路的调控作用,为续断治疗RA作用机制的深入阐释奠定了基础。