增强型绿色荧光蛋白基因在鸡胚盘细胞中的表达

从鸡胚发育为 X期的鸡蛋中取胚盘细胞 ,经原代培养后用带增强型绿色荧光蛋白( EGFP)作为标记基因的真核表达质粒 p L EGFP-C1转染鸡胚细胞观察 EGFP基因的表达情况 ,结果在不同条件下的活细胞均见有 EGFP基因的稳定表达。这提示通过 EGFP基因转染鸡胚盘细胞可连续且直接观察活细胞中的表达 。

基因重组(酵母)乙肝疫苗对HBV转基因小鼠细胞免疫调节作用

为研究基因重组乙肝疫苗对HBV转基因小鼠的免疫调节作用,取经HBsAg免疫的小鼠脾淋巴细胞,制成5×106细胞悬液,分两份,一份经无佐剂HBsAg体外刺激48h后,取上清检测细胞因子;另一份细胞于培养56h后加入3H-TdR,继续培养16h,测定cpm值。结果表明,转基因鼠经多次免疫8个月后,其脾细胞产生的Th1类细胞因子(IL-2、IFN-γ)及T细胞增殖水平均较单次免疫一周后有显著性提高。而采用不同剂量HBsAg按常规免疫时并不能提高IL-2的水平。结果提示,反复大剂量的HBsAg可以打破HBV转基因小鼠的免疫耐受,上调其细胞免疫功能,这为慢性乙肝的临床治疗提供了实验根据。

CD40-CD40L与疾病

T淋巴细胞与抗原提呈细胞之间的信号传递调控着免疫系统的发展 ,其中CD4 0与其配体CD4 0L(CD154)的相互作用 ,不仅对T细胞活化和效应功能的表现起重要作用 ,且在抗感染、抗病毒及抗肿瘤和动脉粥样硬化症中扮演重要角色。本文综述了CD4 0 -CD4 0L与人类疾病关系的研究进展。

复制型HBV转基因小鼠遗传稳定性研究

目的：提高复制型HBV转基因小鼠的遗传稳定性。方法：应用回交传代及双杂交育种法，经荧光定量PCR、ELISA和化学发光法研究HBV基因在小鼠体内的复制与表达。结果：HBV转基因小鼠已稳定传至第23代，血清HBsAg达4122．31±2044．74IU／ml，93．93％的转基因小鼠血清HBVDNA达10^4-10^4copies／ml，表达复制水平较早期有显著提高并稳定传代；雌雄小鼠之间表达水平无显著性差异。结论：该转基因小鼠经过培育传代，已成为一个高表达且遗传稳定的复制型HBV小鼠模型。

心肌肽素对缺血-再灌流损伤大鼠离体心脏的影响

为研究小分子多肽类物质心肌肽素抗心肌缺血 -再灌流损伤作用 ,在大鼠离体 L angendoff's心脏缺血 -再灌流损伤模型上 ,观察心肌肽素对室颤 (VF)发生率及心肌生化指标的影响。结果发现 :心肌肽素能明显降低离体缺血 -再灌流损伤心脏 VF的发生率 ;剂量依赖性地降低心肌乳酸脱氢酶 (L DH)活性和丙二醛(MDA)含量 ;提高心肌肌酸磷酸激酶 (CPK)活性。提示心肌肽素对缺血 -再灌流损伤心肌有保护作用 。

慢性HBV感染者外周血树突状细胞和T细胞体外应答功能的检测和分析

目的 探讨慢性HBV感染者外周血树突状细胞 (DC)和T细胞对激活剂体外应答的功能。方法 用三色荧光染色法 ,通过流式细胞仪检测静息期和经激活剂激活后CD11c+DC和CD3 +/CD4+/CD69+T细胞的百分率。结果 与接种过乙型肝炎疫苗、血中抗HBs阳性健康者相比 ,感染者组CD11c+型DC及其表达CD80和CD40共刺激分子的阳性细胞百分率 ,以及经CD2 /CD2R强激活剂刺激后CD69+T细胞百分率等三项指标均呈明显低下的状态。结论 慢性HBV感染者血中DC和T细胞对激活剂的体外刺激 ,均表现不同程度的应答功能低下或缺陷 ,本研究涉及的三项细胞免疫检测方法有利于深入了解机体对病原体应答的能力 ,其结果有助于阐明发病机理 。

酶联免疫斑点法检测慢性乙型肝炎患者HBcAg特异性分泌γ-干扰素细胞及其临床意义

目的观察免疫应答不同期的慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血中HBcAg特异性γ-干扰素（IFNγ）分泌细胞数，探讨其在评价患者体内非溶细胞机制清除乙型肝炎病毒（HBV）能力中的临床意义。方法采用酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测83例免疫耐受期、49例免疫清除期患者和18名健康人HBcAg特异性IFNγ分泌细胞。结果健康人HBcAg特异性IFNγ分泌细胞数为11—19个／4×10^5个外周单个核细胞（PBMC），62．2％的免疫耐受期CHB患者低于正常值，44．9％的免疫清除期CHB患者高于正常值。HBcAg特异性IFNγ分泌细胞数与HBV DNA水平未发现有相关性，而HBcAg特异性IFNγ分泌细胞数与HBeAg S／N值在一定范围内有正相关趋势。13例免疫耐受期患者经乙型肝炎疫苗及草分枝杆菌制剂治疗3—6个月后，12例患者HBcAg特异性IFNγ分泌细胞数有不同程度提高。结论采用ELISPOT测定HBcAg特异性IFNγ分泌细胞数可从一个侧面反映大多数CHB患者免疫应答能力，并可以作为治疗效果的评价指标。

重组人肝增强因子工程菌JM109的发酵工艺研究

目的：研究表达重组人肝增强团子（hALR）工程菌JM109的发酵工艺。方法：采用发酵罐发酵，优化工程菌发酵的培养基配方、pH值、诱导表达时间、补料方式等。结果：在pH6．9条件下，培养6h后诱导表达5h，同时补科，5L罐发酵工程菌，菌体收得量可达湿重33．0g／L。目标蛋白表达量约占菌体总蛋白的31．3％。结论：此发酵工艺可以较好地提高ALR工程菌菌体得率和目标蛋白表达量。

肝再生增强因子的免疫组化定位及其在肝炎病患者血清水平观察

目的 :探讨肝再生增强因子 (ALR)的组织分布 ,观察肝炎病患者血清ALR的水平。方法 :取鼠、人胎儿系列新鲜组织固定后 ,石蜡包埋切片 ,以SABC试剂盒进行免疫组化染色定位 ;用ELISA法检测肝炎病患者血清ALR水平。结果 :免疫组化染色结果显示 ,ALR在组织细胞中呈胞浆、胞膜型分布 ,尤以睾丸、肝脏染色最深 ;慢性肝炎患者血清ALR水平升高非常显著 (P <0 0 1) ,急性肝炎患者血清ALR水平升高显著 (P <0 0 5 ) ,急、慢性肝炎患者ALR无显著差异。结论 :ALR主要分布肝脏和睾丸组织 ,既无种族特异性 ,也无器官特异 ;肝脏是ALR作用的靶器官 ,其本身也可产生ALR。

心肌肽素抗培养心肌细胞缺氧再给氧损伤作用

目的 观察小分子多肽类物质心肌肽素对缺氧 再给氧损伤培养心肌细胞的保护作用。方法 建立培养心肌细胞缺氧 再给氧损伤模型 ,分别以荧光微量法和光化学扩增法检测心肌细胞内脂质过氧化反应终产物MDA的含量及细胞内SOD活性 ,线粒体脱氢酶活性用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定。结果 心肌肽素可剂量依赖性地降低MDA的含量 ,提高SOD活性及增强受损细胞内线粒体脱氢酶活性。结论 心肌肽素对缺氧

一组抗重组人肝再生增强因子单克隆抗体的制备与鉴定

目的 :制备抗重组人肝再生增强因子 (rhALR)单克隆抗体 (McAb)。方法 :以纯化的rhALR为抗原免疫小鼠 ,取其脾细胞与SP2 /0细胞融合 ,以ELISA ,Westernblot法分别筛选测其滴度及免疫特异性。结果 :获得 2株稳定分泌抗rhALR单克隆抗体杂交瘤株。其效价 ,腹水 10 -3 - 10 -5,培养上清 10 -2 - 10 -3 ,两株McAb针对不同抗原决定簇。结论 :制备的抗体具有高特异性。对rhALR在体内组织器官的分布 。

重组人肝再生增强因子的纯化及生物学活性分析

目的 对在大肠杆菌中表达的重组人肝再生增强因子（rhALR）进行分离纯化及生物学活性分析.方法 以大肠杆菌DH5α发酵表达重组人肝再生增强因子,经包涵体洗涤、变性、目的蛋白复性,以离子交换、分子筛等技术纯化,并进行一系列检定.结果 目的 蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性及柱层析纯化,纯度大于98%,SDS-PAGE测定相对分子质量为30 000,MOLDI-TOF-MS测定其相对分子质量为30 780.522,N-末端15个氨基酸与理论序列一致.Western blot证实rhALR正确表达,等电点5.85～6.85,氨基酸含量与理论值基本符合.动物实验证实rhALR具有明显的促进CCl4毒性肝损伤小鼠肝细胞修复活性.结论 经柱层析纯化的rhALR具有促进小鼠CCl4肝损伤肝细胞修复的活性.

人肝再生增强因子cDNA的克隆及其酵母双杂交载体的构建

目的 :获取人肝再生增强因子 (hALR)阅读框的cDNA及构建其酵母双杂交系统的“诱饵”质粒。方法 :利用RT PCR方法 ,从人胎肝组织中扩增出一约 380bp的DNA片段 ,重组入pGBKT7载体中 ,构建成pGBKT7 hALR ,然后研究此重组质粒在酵母AH10 9中的表达情况并用于筛选人肝cDNA文库。结果 :获得的 378bp的DNA序列与文献报道的人ALR序列一致 ;转化的酵母菌在选择性培养基SD Trp上培养 6 5小时 ,长出约Φ1mm大小的白色菌落 ,而在SD Trp His上不生长 ;酵母提取液的Westernblot分析 ,证实ALR基因在AH10 9以融合蛋白的形式表达 ,并具有免疫活性 ;初步得到hALR相互作用的阳性克隆。结论 :pGBKT7 hALR对宿主菌AH10 9没有毒性作用 ,也没有自身激活报告基因 ,可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”质粒。

肝再生增强因子的免疫组化定位及其在肝炎病患者血清水平观察

目的探讨肝再生增强因子(ALR)的组织分布,观察肝炎病患者血清ALR的水平.方法取鼠、人胎儿系列新鲜组织固定后,石蜡包埋切片,以SABC试剂盒进行免疫组化染色定位;用ELISA法检测肝炎病患者血清ALR水平.结果免疫组化染色结果显示,ALR在组织细胞中呈胞浆、胞膜型分布,尤以睾丸、肝脏染色最深;慢肝炎患者血清ALR水平升高非常显著(P＜0.001),急性肝炎患者血清ALR水平升高显著(P＜0.05),急、慢性肝炎患者ALR无显著差异.结论ALR主要分布肝脏和睾丸组织,既无种族特异性,也无器官特异;肝脏是ALR作用的靶器官,其本身也可产生ALR.

小鼠接种乙肝病毒疫苗产生的细胞免疫反应

目的研究BALB／c(H．2^d)小鼠免疫接种乙肝病毒(HBV)外膜小S蛋白(HBV small S envelop protein，S-HBsAg)产生的细胞免疫方法。方法BALB／c(H-2^d)小鼠腹腔分别接种0、0．65、1．25、2．5、5μg的S-HBsAg；4周后分离脾淋巴细胞，体外分别用特异性多肽或S-HBsAg刺激，分别用^51cr释放实验或^3H掺入实验检测细胞毒T淋巴细胞实验(cytotoxic T lymphocyte，CTL)及辅助T淋巴细胞(helper T lymphocyte，HTL)增殖实验。结果分别接种0、0．65、1．25、2．5、5ug S-HBsAg的BAIB／c(H-2^d)小鼠脾淋巴细胞CTL特异性释放率(平均数±标准差)分别为31．21％±9．23％、42．36％±19．32％、91．21％±22．9r7％、69．25％±24．13％、51．49％±21．661％，均高于靶细胞的自然释放率的平均数+1．96倍标准差(95％可信区间)，差异有统计学意义(P<0．05)；HTL增殖实验的cpm值分别为3830．24±1496．12、2736．19±1238．06、4100．37±1723．74、1246．18±1088．88，均高于未用S-HBsAg刺激的对照组脾淋巴细胞cpm值的平均数+1．96倍标准差(95％可信区间)，差异有统计学意义(P<0．05)。免疫接种S-HBsAg的小鼠产生的CTL与HTL反应及其相关(x^2=5．6979，P<0．05)。结论BALB／c(H-2d)小鼠免疫接种S-HBsAg，产生明显的、相互关联的CTL及HTL反应。

人肝再生增强因子的酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用检测

目的 构建肝再生增强因子的酵母双杂交诱饵质粒，为进一步研究其相互作用蛋白奠定基础。方法 将人肝再生增强因子的编码序列重组入pGBKT载体中，经酶切及序列分析鉴定构建正确后，转化酵母AHl09菌株，转化子在SD／-His／-Trp选择培养基上培养；滤纸法β-半乳糖苷酶活性测定；Westem blot检测目的蛋白表达情况。结果 正确地构建了人肝再生增强因子的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-hALR，其酵母AHl09转化菌在SD／-Trp培养基上30℃培养65h，长出φlmm菌落，而在SD／-Trp-His培养基上不生长，β-半乳糖苷酶活性检测呈阴性。Westem blot结果显示目的蛋白以35KD的融合蛋白形式表达。结论 诱饵质粒pGBKT7-hALR对宿主菌AHl09没有毒性作用，能稳定表达目的蛋白，不能自身激活报告基因，可用于酵母双杂交的筛选工作。

不同剂量重组(酵母)乙肝疫苗对小鼠细胞免疫应答的研究

目的 :探索不同剂量重组 (酵母 )乙肝疫苗对小鼠细胞免疫调节作用。方法 :将HBsAg免疫Balb/C小鼠一周后取淋巴结制备淋巴细胞悬液 ,经HBsAg刺激培养 4 8h后检测其诱导产生的IL 2、IFN γ的水平 ,另一份细胞同样经HBsAg刺激培养 5 6h后 ,用氚 胸腺嘧啶核苷 (3 H TdR)标记 16h后检测T细胞增殖的水平。用不同剂量HBsAg免疫小鼠后 ,检测血清中抗HBsIgG2a的水平。结果 :中、高剂量组小鼠产生的IL 2、IFN γ、抗HBsIgG2a以及T细胞增殖的水平显著高于低剂量组和对照组。结论 :一定剂量的重组 (酵母 )乙肝疫苗可上调小鼠的细胞免疫功能。

大剂量重组HBsAg对HBV转基因小鼠细胞免疫调节作用

目的 利用免疫耐受HBV转基因小鼠动物模型研究大剂量基因重组HBsAg对其免疫调节作用 ,观察对HBV基因表达的影响。方法 比较不同免疫次数、免疫周期、免疫剂量对转基因小鼠所诱生的Th1类细胞因子和T细胞增殖的影响 ,同时检测血清中HBsAg和HBVDNA的含量。结果 多次免疫 9个月后的IL -2 ,IFNγ ,T细胞增殖的水平分别是免疫 1周时的 2 ,17,2倍 ,同时疫苗组的HBsAg的滴度在 6个月时较对照组明显降低 ,9个月时显著降低 ,HBVDNA的检测结果是疫苗组下降 10 2 的有 3只 ,而对照组没有。 9周内免疫一次和两次 ,高、中、低剂量组与对照组所诱生的IL -2水平差异均无显著性。结论 大剂量的基因重组HBsAg可以诱导出高水平的Th1类细胞因子 ,抑制HBV的基因表达 ,打破免疫耐受 。

非酯化脂肪酸对体外培养的牛肝细胞中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶mRNA丰度及其活性的影响

采用荧光定量PCR方法、酶活性速度测定法,探讨了非酯化脂肪酸(NEFA)对体外培养的牛肝细胞中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)mRNA丰度及其活性的影响。结果显示,添加1.5 mmol/L和2.0mmol/L NEFA时,PEPCK mRNA丰度显著低于对照组(P<0.05);添加0.5～2.0 mmol/L NEFA时,PEPCK的活性显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)降低。结果表明,NEFA对体外培养的牛肝细胞中PEPCK mRNA丰度和PEPCK酶活性均具有抑制作用。

硼替佐米对转基因小鼠原代肝细胞HBV的抑制作用

目的利用HBV转基因小鼠原代肝细胞评价蛋白酶体抑制剂硼替佐米的抗病毒效果。方法采用改良的两步灌流法分离HBV转基因小鼠原代肝细胞;分别采用ELISA和荧光定量PCR法检测HBsAg和HBV-DNA的水平;采用MTT法观察不同浓度的硼替佐米对HBV转基因小鼠原代肝细胞和HepG2.2.15细胞的毒性,观察其作用24 h后细胞培养上清中病毒学指标的变化。结果分离的原代肝细胞纯化后活细胞占0.90,HBsAg和HBV-DNA在5 d内均能稳定表达。药物作用24 h后,MTT结果显示260μmol·L-1及以下浓度的硼替佐米对原代肝细胞无明显毒性,但对HepG2.2.15细胞显示较强的细胞毒性,其最大无毒浓度为12.5 nmol·L-1。药物在0.026μmol·L-1～26μmol·L-1的浓度范围内对转基因小鼠原代肝细胞HBsAg和HBV-DNA有明显抑制作用。结论硼替佐米在体外对HBV有抑制作用;HBV转基因小鼠原代肝细胞可用于抗肿瘤药物的抗HBV活性研究。