野外采集牦牛睾丸组织的冷冻保存及其生精细胞的复苏培养研究

采用玻璃化冷冻方法对野外采集的牦牛睾丸组织进行冷冻,通过HE(hematoxylin-eosin)染色分析发现玻璃化冷冻后的牦牛睾丸组织曲细精管结构保存较完好,曲细精管可见大量形态完好的各类生精细胞。采用台盼蓝染色检测细胞活率,发现冷冻复苏后细胞活率可达80.20%。分别通过生精细胞和精原干细胞标志蛋白DDX4和GFRA1免疫荧光染色发现复苏后培养14 d后的生精细胞和精原干细胞的数量明显减少。通过RT-qPCR对复苏后不同实验处理组牦牛睾丸细胞标志基因的表达分析,发现培养30 d的生精细胞中的精原干细胞标志基因%Thy1和UCHL1%的表达量显著增高。因此,玻璃化冷冻保存的牦牛睾丸组织中曲细精管及其生精细胞得到了较好的保护,该方法对于其他哺乳动物生精细胞的长久有效保存具有重要的参考价值。

牦牛与犏牛睾丸支持细胞分离培养及生物学特性比较分析

旨在建立牦牛与犏牛睾丸支持细胞分离培养及鉴定方案,比较两种牛睾丸支持细胞的生物学特性。本研究分别采集24月龄的3头健康公牦牛与3头F1代公犏牛睾丸组织作为2个样品组,其中每组3个生物学重复,分别通过混合酶消化、差速贴壁和饥饿处理分离得到两种牛的睾丸支持细胞,采用DMEM高糖及DMEM/F12培养基培养睾丸支持细胞,筛选更佳的培养体系。采用碱性磷酸酶染色、油红O染色和免疫荧光染色鉴定细胞表型特征,利用CCK8和RT-qPCR法分别检测细胞的增殖活性和标志功能基因的表达,进一步通过不同浓度丝裂霉素C处理两类支持细胞来评价两牛种支持细胞的耐受性及其作为饲养层细胞的潜能。结果,经形态、特殊染色及标志基因表达鉴定,成功分离到牦牛与犏牛睾丸支持细胞,建立了牦牛与犏牛睾丸支持细胞体外长期培养方案。发现DMEM高糖培养基更适用于睾丸支持细胞的增殖,两牛种支持细胞形态相似、轮廓清晰、呈现多边形或长梭形,牦牛睾丸支持细胞的体外增殖速率及活性远高于犏牛。调节精原细胞增殖分化相关基因(胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF)和转化生长因子β1基因(transforming growth factor-β1,TGF-β1))的表达在犏牛支持细胞中分别下调了3.4与2.9倍(P<0.05),基质细胞源性因子12基因(stromal cell-derived factor 12,CXCL 12)的表达在犏牛上调了3.6倍(P<0.05);调节睾丸发育的SRY-盒包含蛋白9基因(sex determining region Y-box9,SOX 9)和睾丸支持细胞特异表达的Wilm肿瘤基因1(Wilms tumor gene1,WT 1)在犏牛支持细胞中的表达分别下调了25.9(P<0.01)与38.7倍(P<0.01)。与牦牛相比,犏牛睾丸支持细胞对于丝裂霉素C具有较差的耐受性,表现为细胞核质分界不清、胞质空泡化严重和悬浮死细胞增多。本研究成功建立了牦牛与犏牛睾丸支持细胞分离纯化与体外培养方案;与牦牛相比,犏牛睾丸支持细胞在增殖活性和睾丸生精细胞分化关键功能基因表达等方面均存在缺陷,这可能也是导致犏牛雄性不育的原因之一。

北川山羊PPARD基因克隆及组织表达分析

本试验从北川山羊的乳腺组织得到PPARD基因序列,并对其特有的生物学特点进行分析,同时将其在不同组织中所表达的情况进行阐述。利用RT-PCR的技术克隆获得北川山羊PPARD基因的序列,采用实时荧光定量PCR检测PPARD基因在北川山羊不同组织和泌乳期的表达丰度。结果表明,所得的北川山羊PPARD基因序列的CDs区有1 326 bp(登录号:XM018039044),由441个氨基酸编码,是不稳定的亲水性蛋白,不存在信号肽序列和跨膜结构。PPARD基因在北川山羊的表达水平最高的是脂肪组织,极显著高于其他组织(p<0.01),在乳腺组织和胃中也有较高的表达。其在泌乳早期的表达水平极显著高于空怀期和干奶期,这为进一步研究PPARD基因在北川山羊乳腺脂代谢过程所起的作用提供了理论基础。