NKT细胞研究进展

NKT细胞是一群介于NK细胞和T细胞间的细胞 ,它们同时表达多种NK细胞和T细胞的一些表面标志分子。在生物体的多种免疫反应中 ,如抗微生物感染 ,自身免疫病的发生 ,移植物的存活和抗肿瘤的发生和转移 。

mCD1.1分子的真核表达及其对NKT细胞的刺激作用

目的:获得稳定表达mCD1.1分子的细胞系,研究其对肝脏和肠系膜淋巴结淋巴细胞的刺激作用。方法:分离C57小鼠的小肠上皮细胞,制备总RNA,通过RTPCR扩增mCD1.1编码区基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1。将所得重组质粒pcDNA3.1mCD1.1通过电穿孔法转至CHO细胞中,在含G418的的选择性培养基中筛选抗性克隆,利用RTPCR和流式细胞术对挑取的克隆进行mCD1.1表达的鉴定。将表达mCD1.1的细胞与新分离的肝脏和肠系膜淋巴结(MLN)的淋巴细胞进行共培养,并用丝裂霉素C抑制CHO细胞的增殖,然后利用MTT法检测淋巴细胞的增殖情况;另外将表达mCD1.1的CHO细胞与淋巴细胞共培养后,分离淋巴细胞,然后用PEantiNK1.1和CychromeantiCD3对其进行标记,利用流式细胞术检测CD3细胞中NK1.1阳性细胞的比例。结果:通过RTPCR,得到mCD1.1的编码区基因,序列与预期相符;通过多次鉴定,证明筛选得到的细胞克隆可稳定表达mCD1.1;CHOmCD1.1细胞与新分离的淋巴细胞共培养,在有无LPS存在的情况下,均能刺激淋巴细胞发生增殖,并使CD3+细胞中NK1.1阳性细胞的比例增加。结论:表达mCD1.1的CHO细胞能够刺激NKT细胞增殖。

曲妥珠单抗联合氟尿嘧啶或顺铂治疗胃癌的实验研究

目的:探讨曲妥珠单抗(Herceptin,HCP)联合氟尿嘧啶(5-FU)或顺铂(PDD)治疗胃癌的效果及机制。方法:采用流式细胞检查确定胃癌细胞株的HER-2/neu(HER2)表达情况,并测定药物对细胞周期的影响;以MTT法评价药物的细胞毒性作用;以Westernblot法分析药物对HER2-PI3K-AKT信号转导的影响;以RT-PCR分析药物对靶蛋白酶mRNA的影响。结果:HCP单抗可增强化疗药对HER2阳性细胞的毒性作用。先予5-FU后予HCP单抗、先HCP单抗和PDD联合再序贯使用HCP单抗的方案效果最佳,但先予HCP单抗再和5-FU联合可拮抗5-FU的化疗效果。HCP单抗单用或与化疗药联用均可抑制AKT的磷酸化,HCP单抗与PDD同时使用可抑制NF-κB的核移位;HCP单抗不能增强5-FU对胸苷酸合成酶(TS)mRNA表达的抑制,但可使PDD上调的核苷酸切除修复交叉互补基因(ERCC1)mRNA恢复至正常水平;联合方案对细胞周期的改变影响明显。结论:HCP单抗更适于与PDD联合用于HER2阳性胃癌的治疗,HCP单抗与PDD同时使用再序贯使用HCP单抗的给药方法可能是最佳联合模式;而HCP单抗与5-FU联合则要注意正确的用药次序,以免减弱5-FU的化疗效果。

混菌发酵中与普通生酮基古龙酸菌产2-酮基-L-古龙酸相关功能蛋白的研究

目的:在混菌发酵中,筛选与小菌产2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)相关的功能蛋白,并分析蛋白表达量的变化与产2-KGA的关系,寻找影响菌体代谢效率的关键性因素。方法:利用蛋白质组学技术,依据小菌产酸曲线,筛选与小菌产2-KGA有一定相关性的蛋白质,并利用生物信息学数据库,分析其改变与小菌代谢的关联。结果:获得了分辨率和重复性均良好的凝胶蛋白图谱,筛选出与小菌生产2-KGA密切相关的8个蛋白。结论:小菌产2-KGA强度与小菌体内抗氧化蛋白表达水平及糖代谢、能量代谢系统密切相关,推测有活性细胞色素C的含量可能为小菌产2-KGA的限制性因素。

金黄色葡萄球菌疫苗的研究进展

金黄色葡萄球菌是引发医院内感染的主要因素之一,近年来由于其多种耐药菌株的出现,发病率迅速攀升,而且通常的抗生素治疗已不可靠。国内外研究者致力于寻找能够预防金黄色葡萄球菌感染的疫苗的有效靶点,如毒素、荚膜多糖、胞外基质结合蛋白、表面多糖、表面蛋白、毒力因子表达调控蛋白等,希望研制出能有效预防金黄色葡萄球菌感染的疫苗。本文主要介绍其近年来的相关研究。

小鼠Semcap2分子的克隆、表达与抗血清制备

目的 获得小鼠Semcap 2蛋白 ,并对其功能进行初步研究。方法 用DNA重组法构建了mSemcap 2cDNA的原核表达质粒pGEX KG mSemcap 2。将重组质粒转入大肠杆菌DH5α,经 0 .3mmol LIPTG在 37℃条件下诱导 3 .5h,行SDS PAGE检测。用 8mol L尿素溶解的包涵体作为免疫原免疫家兔制备多抗。结果 蛋白表达量约占细菌总蛋白的 1 5 %。多抗效价达 1∶1 0 2 4 0 0 ,此多抗可以与重组蛋白及真核转染细胞中的蛋白发生很好的抗原抗体反应。结论 小鼠Semcap 2在大肠杆菌中得到高效表达 ,其抗体的制备为深入研究mSemcap

金黄色葡萄球菌疫苗及其免疫治疗进展

具有多重抗生素耐药性的金黄色葡萄球菌是导致医院感染最常见的致病菌,而目前高致病性耐甲氧西林菌株(MRSA)在社区中的传播使得健康人群也面临极大威胁,因此针对金黄色葡萄球菌的疫苗和免疫治疗的研究迫在眉睫。多数的研究以金黄色葡萄球菌细胞壁锚定蛋白、荚膜多糖、外毒素等为靶点,虽然在一些临床前试验中显示出疫苗和免疫治疗对金葡菌感染具有保护性,但是目前临床试验结果却并不乐观,还没有一个经得起临床检验的疫苗。本文章从临床前试验和临床试验两个方面综述了目前关于金黄色葡萄球菌的疫苗和免疫治疗进展。

表达人前列腺干细胞抗原小鼠前列腺癌模型的建立

目的探讨并建立可供药物评价或生物学功能研究的表达人PSCA抗原的小鼠肿瘤模型。方法克隆人PSCA基因,构建pcDNA-PSCA质粒,稳定转染RM-1细胞,用RT-PCR和流式检测的方法筛选稳定表达人PSCA抗原的RM-PSCA细胞株;再将RM-PSCA细胞接种C57BL/6小鼠,观察其致瘤性,并寻找能够稳定致瘤的细胞数量;进而观测RM-PSCA所致肿瘤的生长情况及小鼠存活状况。结果筛选到了表达人PSCA抗原的RM-PSCA细胞,且1×105个肿瘤细胞能够保证10只实验小鼠全部成瘤;所致肿瘤生长迅速,接种后小鼠的平均存活时间为37 d。结论该研究成功的建立了稳定表达人PSCA抗原的小鼠肿瘤模型。

PSCA-HSP70融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

旨在大肠杆菌中表达PSCA-HSP70融合蛋白,并对其进行纯化。克隆人PSCA基因及HSP70基因,构建表达PSCA-HSP融合蛋白的工程菌,优化表达及纯化条件,对重组蛋白进行纯化。结果表明,成功构建重组表达质粒PSCA-HSP,重组蛋白得到可溶性表达,优化纯化条件后获得90%以上纯度的重组蛋白。本研究成功实现了PSCA与HSP的融合表达,为下一步肿瘤疫苗的研制奠定基础。

前列腺干细胞抗原与热休克蛋白70羧基端结构域的融合表达及纯化

目的构建前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen,PSCA)及热休克蛋白70(heat-shock protein,HSP70)羧基端结构域的重组表达质粒,对重组融合蛋白进行诱导、表达及纯化,为肿瘤疫苗的研究奠定基础。方法克隆人HSP70羧基端基因及PSCA基因,构建重组表达载体pET21-PSCA-HSPC,重组融合蛋白经(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导表达,利用单克隆抗体进行Western blot鉴定,最后进行蛋白纯化。结果成功构建了重组表达质粒pET21-PSCA-HSPC;SDS-PAGE结果显示目的蛋白以可溶性形式存在,经镍柱亲和层析、苯基柱疏水及凝胶过滤柱纯化后,重组融合蛋白纯度在95%以上。结论该研究成功实现了PSCA与HSP70羧基端结构域的可溶性表达。

Galectin-1的生物学活性及其研究进展

随着国内外对凝集素研究的增多,半乳糖凝集素作为凝集素家族的一员日益受到生物学家和免疫学家的关注。它分布广泛,存在于多种组织和细胞内,参与细胞的黏附、增殖、凋亡和炎症反应等多种生理病理过程,并很有可能成为肿瘤和炎症治疗的新的作用靶点。随着对半乳糖凝集素整个家族成员深入的研究,目前已有了许多新的进展,深入细致的分述各个成员很有必要,本文就Galectin-1的研究现状作一综述。

肺癌患者血浆外泌体蛋白质组分析

目的:探究肺癌患者与肺部良性结节病人血浆外泌体中蛋白质组的差异。方法:收集肺癌与肺部良性结节病人的术前血浆,随机选取肺腺癌病人血浆15例、肺鳞癌病人血浆10例作为实验组,肺部良性结节病人血浆5例作为对照组,采用超速离心法分离得到外泌体,定量质谱鉴定分析肺癌病人与肺部良性结节病人血浆外泌体蛋白质表达的差异性,SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检验提取到的蛋白质。结果:共检测到血浆外泌体蛋白质253个,并初步确定其中18个在肺癌病人血浆外泌体中表达上调,8个在肺癌病人血浆外泌体中表达下调,免疫印迹法验证了上调蛋白质中的补体蛋白C4a。结论:鉴定出26个外泌体差异表达蛋白质,为肺癌早期诊断提供了新的候选分子。

人自噬相关蛋白ATG7的原核表达及纯化鉴定

目的:原核表达并纯化自噬相关蛋白ATG7,初步鉴定其生物学活性。方法:利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人ATG7基因的编码序列,插入载体p ET-28a(+)得到重组质粒,经Bam HⅠ和NotⅠ双酶切鉴定后转化大肠杆菌Rossate菌株进行小量诱导,纯化融合蛋白His-ATG7,通过Western印迹和SDS-PAGE检测融合蛋白的纯化效果。结果:用PCR技术从人乳腺文库中扩增得到约2031 bp的目的片段,插入载体p ET-28a(+)后构建出His-ATG7重组质粒,并经酶切鉴定及测序证实无误;转化大肠杆菌Rossate并进行小量诱导,纯化后SDS-PAGE检测显示获得相对分子质量约为78×103的融合蛋白。结论:纯化得到原核系统表达的His-ATG7融合蛋白,为后续研究ATG7在自噬中的作用机制奠定了实验基础。

用Touch-Up PCR克隆中国仓鼠存活蛋白基因及其序列分析

目的:通过Touch-UpPCR(上升PCR)的方法从中国仓鼠卵巢细胞中克隆存活蛋白基因,并对其进行序列分析。方法:分别从293、H22、CHO-S细胞中提取总RNA并反转录得cDNA,然后用Touch-UpPCR克隆存活蛋白基因。结果:获得了存活蛋白基因,全长423bp,序列测定及同源性分析表明其与GenBank中报道的人以及小鼠的存活蛋白基因高度同源,同源性分别为84.8%和88.2%;氨基酸序列分析表明它们的蛋白产物具有功能相同的BIR结构域。结论:从中国仓鼠卵巢细胞中首次克隆到存活蛋白基因。

炭疽毒素保护性抗原的不同结构域对其表达可溶性的影响

目的:对炭疽毒素保护性抗原(PA)的不同结构域进行了缺失突变,以期找到免疫原性降低而功能变化不大的PA蛋白突变体。方法:在对PA结构域的缺失突变体进行表达时,意外发现不同的突变体表达效果之间存在很大差异,遂用DNAStar软件对PA的4个结构域和突变体进行分析。结果:PA蛋白结构域2的表面特性与其他结构域存在很大差异。结论:推断这种表面特性影响了PA突变体的可溶性特征。

人自噬相关蛋白ATG5的原核表达及纯化

目的:原核表达纯化带His标签的自噬相关蛋白ATG5。方法:利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人ATG5基因的编码序列,插入载体p ET-28a(+)中得到重组质粒,经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后转化大肠杆菌Ros-sate进行小量诱导,挑选出可以诱导His-ATG5蛋白的菌液进行融合蛋白的纯化,通过Western印迹和SDS-PAGE检测融合蛋白的纯化效果。结果:用PCR技术从人乳腺文库中扩增得到约828 bp的目的片段,插入载体p ET-28a(+)构建出His-ATG5重组质粒并经酶切及测序验证;转化大肠杆菌Rossate后进行小量诱导表达并纯化蛋白,SDS-PAGE检测显示获得相对分子质量约为38×103的融合蛋白。结论:原核表达并纯化获得His-ATG5融合蛋白,为后续研究ATG5在自噬中的作用机制奠定了实验基础。

传统方法和分子生物学方法鉴定过氧化氢酶阴性、革兰阳性需氧球菌的比较研究[英]Bosshard PP…／／J Clin Microbiol

表型试验是目前临床实验室中常用鉴定过氧化氢酶阴性、革兰阳性需氧球菌的方法，但是该方法存在着一些问题：同一种属的不同菌株问性状可能不同、同一菌株在重复实验中的结果可能不同、相应的数据库不太完备、得出实验结果需要个人解释和专业技术等，而且实验中一个微小的改变也可能导致错误的结果。

用HLA-A2.1转基因鼠研究丙型肝炎病毒自然感染时的表位排列

丙型肝炎病毒(HCV)的治疗效果很大程度上取决于所感染HCV的基因型。有效的HCV疫苗必须能诱导强而持续的免疫反应,其中诱导广谱的CD8^+T细胞应答最为重要。

乙型肝炎病毒核心颗粒重组疟疾表位疫苗的免疫原性研究

全世界有2～4亿的疟疾感染者,且每年有100万～200万人死于恶性疟疾。既往研制的疟疾疫苗有用放射线照射的疟原虫孢子体、合成肽疫苗和重组乙型肝炎病毒(HBV)颗粒疟疾疫苗。以放射线照射的孢子体免疫可诱导保护性体液和细胞免疫,缺点是孢子体不能在体外进行培养。合成肽疫苗包含环孢蛋白(CS)