牛种布鲁氏菌A19ΔBtpA缺失株生物学特性及其免疫原性研究

布鲁氏菌四型分泌系统(T4SS)效应物BtpA是布鲁氏菌的重要免疫抑制分子之一。为了进一步了解BtpA对牛种布鲁氏菌生物学特性的影响,并探究BtpA基因缺失是否会影响布鲁氏菌的免疫原性。在牛种布鲁氏菌疫苗株(A19株)上对BtpA基因进行了缺失,通过qRT-PCR检测布鲁氏菌A19ΔBtpA缺失株中的BtpA mRNA表达水平,并探究布鲁氏菌A19株和A19ΔBtpA缺失株在生长曲线、胞内生存、黏附侵袭和体外应激方面的差异。此外,将A19株和A19ΔBtpA缺失株免疫小鼠,在免疫后的第7、14、21、28和35天使用间接ELISA检测小鼠体内的布鲁氏菌特异性抗体水平;通过ELISpot检测免疫第21天时小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ的表达水平,利用流式细胞术测定了小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ阳性CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞以及CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞的分类情况。结果表明:成功构建了A19ΔBtpA缺失株,A19ΔBtpA缺失株中BtpA的转录水平显著低于A19株,A19ΔBtpA缺失株与亲本株在生长曲线、胞内生存和黏附侵袭方面呈现相似的趋势。而体外应激试验显示,高渗应激条件下A19ΔBtpA缺失株的存活菌量明显低于A19株(P<0.05)。免疫原性研究中,与PBS组相比,A19组和A19ΔBtpA组均可极显著诱导小鼠产生布鲁氏菌特异性抗体(P<0.01);与A19组相比,A19ΔBtpA组淋巴细胞IFN-γ表达水平显著升高(P<0.05),使小鼠产生的IFN-γ阳性CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞以及CD4^(+)/CD8^(+)T细胞比值显著增高(P<0.05)。BtpA基因缺失不会影响布鲁氏菌A19体外胞内增殖,但可能参与布鲁氏菌抗高渗环境能力相关。此外,A19ΔBtpA缺失株比A19株更好地诱导Th1型免疫应答,诱导宿主产生与A19株相当的IgG特异性抗体,具有布鲁氏菌基因缺失疫苗的潜力。该研究将为进一步探究布鲁氏菌的致病机制和开发基因缺失株疫苗提供理论基础和数据支持。

布鲁氏菌重组L7/L12蛋白对小鼠免疫保护效果的评价

为探究布鲁氏菌候选保护性抗原L7/L12的免疫原性及其对小鼠的免疫保护效果,本研究经PCR扩增羊种布鲁氏菌16M株L7/L12基因,构建重组质粒pET-22b-L7/L12,经双酶切鉴定正确后转化E.coli BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达并纯化后利用SDS-PAGE与western blot检测。结果显示,获得了16 ku的重组L7/L12蛋白(rL7/L12),且纯化效果较好。将rL7/L12以100μg/只腹腔注射免疫6周龄SPF BALB/c小鼠,14 d后以50μg/只加强免疫。首免后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d及49 d分别对所有小鼠尾静脉采血,通过间接ELISA方法检测小鼠血清中的IgG抗体、其亚型(IgG1、IgG2a)抗体水平及二者比值;并利用ELISA方法检测首免后21 d和35 d两组小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-10和TNF-α的分泌水平。结果显示,首免后14 d,小鼠血清中IgG抗体水平迅速升高,于首免后21 d达峰值并持续至首免后49 d(P<0.01),对照组小鼠则一直无抗体产生;首免后14 d,rL7/L12组小鼠血清中的IgG1抗体水平极显著高于IgG2a抗体水平(P<0.01),且IgG1/IgG2a大于1;但首免后42 d,rL7/L12组小鼠血清中IgG2a抗体水平极显著高于IgG1(P<0.01),IgG2a/IgG1比值大于1。表明在免疫前期,rL7/L12主要诱导小鼠的Th2型体液免疫反应,免疫后期主要诱导小鼠Th1型细胞免疫反应。首免后21 d和35 d,rL7/L12组小鼠IL-2和TNF-α含量极显著高于PBS对照组(P<0.01),首免后35 d,该组小鼠抑炎因子IL-10的含量极显著低于PBS对照组(P<0.01)。首免后21 d和35 d,分别剖杀每组小鼠,分离小鼠脾淋巴细胞,利用ELISpot法检测各组小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ的分泌水平。结果显示,首免后21 d,rL7/L12组小鼠脾淋巴细胞IFN-γ的分泌水平有所升高,但与PBS对照组无显著差异(P>0.05);但免疫后35 d,rL7/L12组小鼠脾淋巴细胞IFN-γ分泌水平显著高于PBS对照组(P<0.05)。上述结果表明,rL7/L12免疫后期刺激小鼠机体产生Th1型细胞免疫反应,与抗体检测结果相符。首免后42 d通过腹腔注射途径以100μL(含1×10^(5)cfu/只)的羊种布鲁氏菌新疆流行株043攻击小鼠,攻毒后观察死亡情况,15 d后剖杀全部小鼠,通过检测其脾脏指数及脾脏载菌量(cfu)评价rL7/L12对小鼠的保护效果,结果显示,攻毒后15 d PBS对照组小鼠精神沉郁,但两组小鼠均无死亡;rL7/L12组小鼠的脾指数和脾脏载菌量均显著低于PBS对照组(P<0.05)。本研究结果首次表明,rL7/L12免疫小鼠后能够刺激小鼠的Th2型体液免疫反应和Th1型细胞免疫反应,且以Th1型细胞免疫反应为主。本研究为布鲁氏菌L7/L12亚单位疫苗的研发奠定了基础。

布鲁氏菌外膜囊泡生物信息学分析及免疫原性评价

【目的】探索布鲁氏菌外膜囊泡(OMVs)在亚单位疫苗上的应用前景,制备布鲁氏菌OMVs亚单位疫苗,评估布鲁氏菌OMVs的免疫原性。【方法】利用高速离心法制备羊种布鲁氏菌OMVs,通过透射电镜、SDS-PAGE和生物信息学分析对制备的OMVs进行形态和组分分析;使用纳米佐剂(LDH)和弗氏佐剂乳化OMVs后免疫小鼠,通过间接ELISA方法检测免疫后7、14、21、28和35 d小鼠血清中的特异性抗体,利用小鼠IgG ELISA检测试剂盒检测免疫后小鼠血清中IgG抗体水平,评估OMVs诱导产生的体液免疫水平;通过小鼠脾脏淋巴细胞分离与细胞因子白细胞介素4(IL-4)和γ-干扰素(IFN-γ)测定及小鼠外周血T淋巴细胞亚群的流式细胞术测定评估OMVs免疫小鼠的细胞免疫水平。【结果】成功提取并纯化了布鲁氏菌OMVs,其直径大小为20~160 nm。生物信息学分析结果显示,OMVs主要组成蛋白OMP25、OMP31、OMP16、OMP19、BP26及SOD均属于亲水性蛋白和抗原性蛋白,且存在多个B细胞和T细胞优势抗原表位。与PBS组相比,OMVs免疫小鼠后,不同佐剂组均可诱导小鼠产生高水平的特异性抗体和IgG抗体(P<0.01);同时OMVs可显著诱导小鼠脾脏淋巴细胞产生IFN-γ(P<0.05),并促进了CD4^(+)T细胞的表达(P<0.05)。【结论】本研究证实了羊种布鲁氏菌OMVs具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生强烈的体液免疫和细胞免疫反应,为布鲁氏菌新型亚单位疫苗的开发奠定了理论基础。

猪轮状病毒VP4基因重组腺病毒的构建及抗体水平评价

【目的】构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因重组腺病毒,为开发PoRV候选基因工程疫苗奠定基础。【方法】参考GenBank中流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因序列(登录号:MH898990.1)合成PoRV VP4基因,将得到的目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV进行重组,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-VP4;腺病毒穿梭载体经过PmeⅠ内切酶线性化处理后与含有腺病毒骨架pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组获得重组质粒pAd-VP4,对重组质粒进行PacⅠ酶切鉴定,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将重组质粒转染HEK293A细胞获得重组腺病毒rAd-VP4,对该重组腺病毒进行扩大培养并测定重组腺病毒的半数组织培养感染剂量(TCID50);通过RT-PCR检测其体外表达情况,Western blotting检测其反应原性;将制备的重组腺病毒用不同病毒滴度和不同免疫次数对小鼠进行腹腔免疫,收集血清通过ELISA法测定IgG抗体水平。【结果】RT-PCR扩增出1条大小为2343 bp的rAd-VP4重组腺病毒条带,测序结果正确,表明重组腺病毒rAd-VP4构建成功,测得rAd-VP4病毒滴度为106.5TCID50,Western blotting结果表明,重组腺病毒rAd-VP4在蛋白水平上得到了正确表达,蛋白的分子质量约为87 ku。小鼠IgG抗体检测结果表明,在用106.5TCID50rAd-VP4免疫后的第35和42天,小鼠血清中的IgG抗体水平显著高于105.3TCID50TGE-PED-PRV三联活疫苗IgG抗体水平(P<0.05);106.5TCID50rAd-VP4在免疫后第35和42天产生的抗体水平显著高于105.5和104.5TCID50rAd-VP4(P<0.05),而105.5TCID50rAd-VP4在免疫后第28天产生的抗体水平显著高于106.5和104.5TCID50rAd-VP4(P<0.05)。106.5TCID50rAd-VP4的2次免疫和3次免疫产生的IgG抗体在不同免疫时间均差异不显著(P>0.05)。【结论】本研究成功构建了重组腺病毒rAd-VP4,其病毒滴度为106.5TCID50。106.5和105.5TCID50rAd-VP4分别在第42和28天产生较高的IgG抗体水平,2次免疫和3次免疫对产生IgG抗体水平均无显著影响。试验结果可为开发PoRV重组腺病毒候选疫苗提供参考。

冠状病毒与宿主细胞受体相互作用的研究进展

冠状病毒(Coronavirus)是一类有囊膜的单股正链RNA病毒,具有复杂的进化历史,属于套式病毒目,冠状病毒科,冠状病毒亚科,冠状病毒属,这类病毒能广泛感染野生、家养禽类和哺乳动物^([1])。冠状病毒是目前已知的RNA病毒中基因组最大的病毒,成熟的冠状病毒直径为60~220 nm,分为4个不同的属:α、β、γ和δ冠状病毒(图1)。冠状病毒粒子多呈现球形或不规则形,其基因组大小介于26 000~32 000 bp,长度约为30 kb^([2]),包含6~11个开放阅读框(Open reading frame,ORF),第一个ORF占整个基因组约67%,编码16种非结构蛋白(Nonstructural protein)^([3]),其余的ORF编码辅助蛋白和结构蛋白。4种主要的结构蛋白为刺突表面糖蛋白(S)、包膜蛋白(E)、基质蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)^([4])(图2A、2B)。S蛋白在结合宿主细胞上的受体中起着至关重要的作用,也决定了病毒的宿主向性^([5,6])。冠状病毒可以通过S蛋白的突变或与其他毒株重组获得与新的宿主受体结合的能力,从而发生组织或宿主嗜性的改变。冠状病毒受体特异性的改变决定了病毒的进化方向和跨种间传播。冠状病毒因其跨越多种宿主物种屏障的灵活性而闻名,具有传播人兽共患疾病的能力。

牛病毒性腹泻病毒NS3基因的生物信息学分析、蛋白纯化及免疫原性分析

为了探讨牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3(P80),并获得具有较高免疫原性的NS3重组蛋白,利用生物信息学研究方法对NS3蛋白氨基酸进行序列分析;经PCR技术扩增NS3基因序列;通过无缝克隆技术构建pET-22b(+)-NS3重组表达质粒,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,诱导其表达NS3重组蛋白并提纯;通过Western Blotting方法检测其反应原性;将获得的较高纯度的NS3重组蛋白免疫BABL/c小鼠,收集血清,ELISA方法分别检测血清中IgG、IgG1和IgG2a抗体水平;最后通过病毒中和试验检测其中和病毒的能力。结果表明:NS3蛋白氨基酸序列中无信号肽和跨膜区,二级结构主要以无规则卷曲为主,且NS3氨基酸序列中含有优势抗原表位;利用PCR和无缝克隆技术成功构建了pET-22b(+)-NS3重组表达载体,经诱导表达获得了较高纯度的NS3重组蛋白,大小约为75 ku,与理论大小相符;Western Blotting结果表明,NS3重组蛋白具有较高的反应原性;ELISA检测NS3重组蛋白免疫后的小鼠能够产生高水平的IgG、IgG1和IgG2a抗体,结果显示,免疫组小鼠产生的抗体水平极显著高于PBS阴性对照组(P<0.01);血清中和抗体水平也极显著高于PBS阴性对照组(P<0.01)。总之,成功获得了纯度高且具有免疫原性的NS3重组蛋白。

布鲁菌对不同分化类型巨噬细胞JAK-STAT6信号通路的影响

为研究布鲁菌侵染巨噬细胞过程中,对后者不同分化类型细胞中JAK-STAT6信号通路和细胞因子表达变化的影响,本研究利用小鼠巨噬细胞系RAW264.7,经40 ng/m L的IL-4体外作用24 h将其诱导为M2型巨噬细胞,采用细胞免疫荧光方法,检测M2巨噬细胞极化状态;通过荧光定量PCR(q RT-PCR)方法,检测布鲁菌疫苗株M5侵染不同类型(M0和M2型)巨噬细胞中JAK1、STAT6基因mRNA转录情况;采用ELISA方法检测M5侵染不同类型巨噬细胞上清中IL-10、INF-γ的表达情况。细胞免疫荧光检测结果显示,IL-4诱导24 h后,巨噬细胞表面标志CD206荧光表达量超过90%,表明巨噬细胞极化为M2型;q RT-PCR结果显示,M5侵染M0型巨噬细胞后能够引起JAK1、STAT6 mRNA转录水平持续降低,在24 h和48 h时其转录水平最低,二者差异极显著(p<0.01);而M5侵染M2型巨噬细胞后,与未极化组(M0型)相比,JAK1、STAT6的mRNA转录水平增高,同时存在时间差异性,侵染8 h时,二者mRNA转录水平最高,差异极显著(p<0.01)。ELISA结果显示,M5侵染巨噬细胞后,极化组(M2型)与未极化组(M0型)巨噬细胞相比,INF-γ的表达量差异不显著(p>0.05),而IL-10的表达量上调且在侵染48 h达到最大值,差异显著(p<0.05)。上述结果表明,在IL-4的诱导下巨噬细胞可以从未极化的M0型极化为M2型;布鲁菌M5侵染M0型巨噬细胞中JAK1、STAT6的转录水平下调,但上调M2型巨噬细胞JAK1、STAT6的转录水平并促进下游细胞因子IL-10的分泌。本研究为探究布鲁菌引起持续感染的机制研究奠定了基础,同时为布鲁菌病药物靶标开拓了新的研究方向。

布鲁氏菌胞内存活机制与巨噬细胞极化关系研究进展

布鲁氏菌(Brucella)是一种兼性胞内寄生致病菌,虽无典型的毒力因子却有很强的致病力,且常导致慢性持续感染。布鲁氏菌病被列入世界上严重的人兽共患病之一,直接对畜牧业造成重大经济损失,严重威胁人类健康和公共卫生安全。布鲁氏菌感染的靶细胞主要是巨噬细胞,其发展了更高的策略逃逸宿主免疫细胞的杀伤,甚至在细胞内大量繁殖,削弱巨噬细胞的功能,使巨噬细胞的杀伤作用和抗原递呈功能部分丧失,从而能在宿主细胞内长期持续性感染。文章围绕布鲁氏菌胞内存活机制进行探讨,分析了不同极化类型的巨噬细胞在布鲁氏菌感染过程中的调控作用,以及相关炎症通路对机体炎症发展的作用;揭示了布鲁氏菌胞内生存不仅可适应持续感染期间不同的免疫微环境,也可适应感染期间靶细胞营养物质利用率的差异;证实了在慢性感染的过程中免疫逃避和与宿主细胞代谢的相互作用起关键作用;解释了NF-κB通路是调节M1/M2型巨噬细胞亚型平衡状态的关键因素。布鲁氏菌在宿主细胞中持续感染是国内外学者所面临的巨大难题,其免疫逃逸机制和致病机制仍需进一步研究。

NF-κB信号通路调控布鲁氏菌胞内存活分子机制的初步研究

本试验用布鲁氏菌强、弱毒株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,旨在探讨NF-κB信号通路与布鲁氏菌强、弱毒株在胞内生存的关系。采用光滑型牛布鲁氏菌2308、粗糙型牛布鲁氏菌RB51在不同感染复数下侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,侵染0、4、8、24h后,裂解细胞收集蛋白,Western blotting检测布鲁氏菌对激活NF-κB信号通路的影响。利用不同浓度的NF-κB信号通路抑制剂处理小鼠巨噬细胞RAW264.7,然后用布鲁氏菌在不同感染复数下侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,ELISA试剂盒检测细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达量;同时对胞内菌CFU进行计数。结果显示粗糙型牛布鲁氏菌RB51可以强烈激活NF-κB信号通路,光滑型牛布鲁氏菌2308对其激活作用较弱;同时对NF-κB信号通路的激活具有浓度依赖性,在感染复数为80∶1、侵染时间为8h时光滑型牛布鲁氏菌2308和粗糙型牛布鲁氏菌RB51对NF-κB激活程度最强,且该通路参与产生TNF-α、IL-1β和IL-6;NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082影响布鲁氏菌在胞内的生存。因此,粗糙型牛布鲁氏菌RB51胞内存活与NF-κB信号通路密切相关,为进一步研究布鲁氏菌的胞内致病机制奠定基础,也为布鲁氏菌新型药物的研发、家畜布鲁氏菌病预防和治疗提供科学依据。

miR-145a-3p通过靶向ATG14调控布鲁氏菌诱导的RAW264.7自噬

【目的】探究miR-145a-3p对布鲁氏菌诱导的巨噬细胞(RAW264.7)自噬及其对布鲁氏菌胞内生存的影响。【方法】首先合成自噬相关miRNA miR-145a-3p的模拟物(miR-145a-3p mimics)和抑制剂(miR-145a-3p inhibitor)及对照模拟物(NC mimics),转染至GFP-RFP-RAW264.7细胞中,然后用布鲁氏菌侵染该细胞24 h,通过激光共聚焦显微镜观察miR-145a-3p对自噬的影响;运用TargetScan、miRBase等生物信息学软件预测miR-145a-3p的靶蛋白;通过构建PmirGLO-ATG14-3′UTR和PmirGLO-ATG14-3′UTR-mutation重组质粒,用SacⅠ和KpnⅠ进行双酶切鉴定,并利用双荧光素酶报告系统验证miR-145a-3p与自噬相关基因(autophagy-related gene 14,ATG14)的靶向关系;将RAW264.7细胞培养至60%汇合时,分别转染miR-145a-3p mimics、miR-145a-3p inhibitor和NC mimics,转染7 h后用布鲁氏菌侵染,添加PBS作为未感染对照,培养24 h收集细胞,利用实时荧光定量PCR、Western blotting检测miR-145a-3p对ATG14 mRNA和蛋白表达的调控作用;最后通过布鲁氏菌侵染已转染miR-145a-3p的巨噬细胞,进行菌落计数,验证miR-145a-3p对布鲁氏菌胞内生存的影响。【结果】miR-145a-3p mimics促进布鲁氏菌诱导的细胞自噬,miR-145a-3p inhibitor抑制布鲁氏菌诱导的细胞自噬;软件预测结果表明,miR-145a-3p靶基因为自噬相关蛋白ATG14-3′UTR;双酶切结果显示,重组质粒PmirGLO-ATG14-3′UTR和PmirGLO-ATG14-3′UTR-mutation构建成功;双荧光素酶报告基因系统验证miR-145a-3p mimics与ATG14-3′UTR互相作用时,与NC mimics组相比,miR-145a-3p mimics组荧光值极显著降低(P<0.01)。与NC mimics组相比,未感染布鲁氏菌时,miR-145a-3p mimics组ATG14 mRNA水平极显著降低(P<0.01)、ATG14蛋白的表达水平显著降低(P<0.05),miR-145a-3p inhibitor组ATG14 mRNA水平极显著上调(P<0.01);布鲁氏菌感染后,miR-145a-3p mimics+Bru组ATG14 mRNA水平极显著提高(P<0.01),且miR-145a-3p mimics+Bru组ATG14 mRNA的水平显著高于NC mimics+Bru组(P<0.05)。miR-145a-3p mimics促进ATG14蛋白的表达水平。miR-145a-3p的过表达导致布鲁氏菌的胞内生存数量显著降低(P<0.05)。【结论】miR-145a-3p在布鲁氏菌感染细胞后高表达,miR-145a-3p通过靶向ATG14促进自噬,抑制布鲁氏菌复制。

布鲁氏菌GMD重组蛋白表达及对昆明系小鼠的免疫效果研究

【目的】对布鲁氏菌GMD蛋白进行生物信息学预测分析和免疫原性研究,并在小鼠模型上评价其免疫效果。【方法】对GMD蛋白进行生物信息学分析,分析预测其结构及功能,采用PCR技术对布鲁氏菌gmd基因进行特异性扩增,与p ET-28a表达载体连接后转化至E.coli BL21(DE3)中,通过SDS-PAGE和Western Blot检测目的蛋白的表达及其反应原性,并通过小鼠免疫和攻毒实验评价其免疫原性以及免疫保护力。【结果】生物信息学分析显示,该蛋白无跨膜区结构,有15个抗原决定簇,不存在信号肽,二级结构以α-螺旋为主。并利用Phyre2服务器成功构建了该蛋白的三维模型。SDS-PAGE分析表明获得了约43.7 ku的融合蛋白,Western Blot结果显示该融合蛋白与羊抗布鲁氏菌阳性血清发生特异性反应。间接ELISA结果显示,免疫小鼠7、14、21 d,实验组小鼠均可产生抗体,且随时间增加抗体水平也随之升高。免疫保护力测定结果显示小鼠脾指数和脾脏CFU均低于PBS组。【结论】GMD重组蛋白具有良好的反应原性,其免疫小鼠后可诱导产生高水平的特异性抗体,具有良好的免疫原性;攻毒后能发挥一定免疫保护作用。

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统对树突状细胞自噬、胞内生存和炎症反应的影响

为探究Ⅳ型分泌系统在布鲁氏菌(Brucella)感染过程中的作用,深入了解布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统在疫苗开发中的潜力,本研究以牛种布鲁氏菌A19疫苗株为研究对象,使用A19 VirB启动子缺失株感染小鼠树突状细胞(DCs),通过菌落计数(CFU)评估Ⅳ型分泌系统对布鲁氏菌黏附侵袭及胞内生存的影响,同时对感染的细胞进行RNA和总蛋白的提取,分别通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测自噬基因Beclin-1的转录和表达情况;收集感染后的细胞上清液,利用ELISA检测炎症因子白细胞介素-6(IL-6)和IL-10的分泌水平。黏附侵袭结果显示,布鲁氏菌VirB启动子缺失株与亲本株A19的黏附侵袭水平无显著差异(P>0.05);胞内生存试验发现,感染的4 h,布鲁氏菌VirB启动子缺失株的胞内存活能力显著低于亲本株A19(P<0.05),感染后0、24和48 h极显著低于亲本株A19(P<0.01);实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,感染后4、8和12 h,布鲁氏菌VirB启动子缺失株刺激细胞产生Beclin-1的水平极显著高于亲本株A19(P<0.01);ELISA结果显示,感染后8和12 h,布鲁氏菌VirB启动子缺失株刺激细胞产生IL-6的水平显著高于亲本株A19(P<0.05),而在感染后8和12 h,布鲁氏菌VirB启动子缺失株刺激细胞分泌IL-10的水平显著低于亲本株A19(P<0.05),感染24 h时极显著低于亲本株A19(P<0.01)。综上所述,当VirB启动子缺失后,布鲁氏菌对DCs的黏附侵袭能力并未明显改变,但显著降低了布鲁氏菌在DCs内的存活能力,提升了DCs的自噬水平,促进了DCs IL-6的分泌,抑制了IL-10的分泌。本研究初步探究了布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统在感染DCs过程中的生物学作用,为后续布鲁氏菌疫苗改造研究奠定了理论基础。

新疆某地区3个牧场布鲁氏菌病流行状况调查及分析

为调查新疆某地区牛、羊布鲁氏菌感染情况,收集该地区3个牧场共3223份样本,其中牛血液样本1404份、羊血液样本1590份、牛流产胎儿样本66份、羊流产胎儿样本75份、牛生鲜乳样本65份及羊生鲜乳样本23份。血液样本经血清分离后进行虎红平板凝集试验(RBPT),流产胎儿样本的部分脏器及生鲜乳样经DNA提取后进行聚合酶链反应(PCR).将PCR结果为阳性的样本进一步进行PCR扩增及系统进化树分析。RBPT结果显示,3个牧场RBPT平均阳性率为牛6.8%,羊9.5%;其中牧场A阳性率为牛7.1%,羊9.1%;牧场B阳性率为牛11.7%,羊10.8%;牧场C阳性率为牛4.2%,羊9.1%。经PCR共鉴定出54份布鲁氏菌阳性样本,其中包括牛流产胎儿22份、羊流产胎儿30份、羊生鲜乳1份及牛生鲜乳1份,其余均为阴性。从上述PCR阳性样本中共鉴定出38份为羊种布鲁氏菌,其中包括牛流产胎儿16份、羊流产胎儿20份、牛生鲜乳1份及羊生鲜乳1份。系统进化树分析表明,鉴定出的羊种布鲁氏菌与内蒙古地区、挪威及印度等国分离的羊种布鲁氏菌生物3型菌株亲缘关系非常接近。综上所述,羊种布鲁氏菌是引起该地区牛、羊布鲁氏菌病的主要病原菌。研究结果为新疆地区控制和预防布鲁氏菌的感染提供了流行病学依据。

牛种布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统对巨噬细胞内质网应激和细胞凋亡的影响

旨在研究牛种布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统(T4SS)对巨噬细胞内质网应激和细胞凋亡的影响,深入探究布鲁氏菌的分子致病机制。本研究以牛种布鲁氏菌疫苗株A19及其T4SS启动子缺失株A19ΔVirB侵染小鼠巨噬细胞,分别在侵染的6、12、24 h收集细胞RNA和总蛋白,通过qRT-PCR以及Western blot检测内质网应激标志性分子(GRP78和CHOP)、凋亡相关分子(BAX和BCL-2)的转录水平和蛋白表达水平;通过流式细胞术检测不同时间点的细胞凋亡情况。结果显示,在侵染的6、12和24 h,缺失株A19ΔVirB组GRP78的转录水平及蛋白表达水平均显著低于亲本株A19组(P<0.05);在侵染后的6 h,缺失株组CHOP的转录水平及蛋白表达水平也显著低于亲本株(P<0.05),但到了24 h,出现了显著高于亲本株(P<0.05)的现象;在侵染的24 h,缺失株A19ΔVirB组BAX的转录水平及蛋白表达水平显著高于亲本株(P<0.05);而在侵染的24 h,缺失株组BCL-2的转录水平及蛋白表达水平显著低于亲本株(P<0.05);流式结果进一步显示,在侵染的24 h,缺失株组的细胞凋亡率显著高于亲本株(P<0.05);本试验的结果表明,T4SS缺失后,会导致牛种布鲁氏菌引起内质网应激的能力减弱,诱导细胞凋亡的能力增强。本研究为进一步解析布鲁氏菌的致病机制奠定了基础,也为今后布鲁氏菌T4SS的功能研究提供了科研依据。

布鲁氏菌OMP10介导的小鼠骨髓源树突状细胞活化及其对小鼠T细胞增殖影响的研究

为探究布鲁氏菌外膜蛋白10(OMP10)介导小鼠骨髓源性树突状细胞(BMDC)的活化机制及其对小鼠T淋巴细胞增殖的影响。本研究通过体外分离培养BMDC细胞6 d后,将重组OMP10(rOMP10)与BMDC共孵育24 h,经流式细胞术分析BMDC表面共刺激分子(CD40、CD80、CD86)的表达情况,结果显示,与PBS组相比,rOMP10孵育BMDC能够诱导细胞表面共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达量显著升高(P<0.001)。同时采用ELISA检测共孵育后BMDC细胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-10、IL-4)的表达情况,结果显示,与PBS组相比,rOMP10孵育BMDC能够诱导其细胞因子(IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ)表达量极显著升高(P<0.01),但IL-4和IL-10的表达量极显著降低(P<0.001)。进一步采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测共孵育后BMDC的Toll样受体(TLRs)和MHC-I、MHC-II类分子的mRNA转录水平,结果显示,与PBS组相比,rOMP10能够诱导BMDC的TLR2和TLR4(P<0.05),以及抗原递呈相关分子MHC-I和MHC-II的mRNA转录水平极显著升高(P<0.01)。另外,将小鼠脾脏T淋巴细胞与rOMP10预处理的BMDC共孵育后,经MTT试验检测T淋巴细胞增殖效率,结果显示,rOMP10处理组比PBS组T淋巴细胞的刺激指数增加2倍以上,且在树突状细胞和淋巴细胞比值(DCs:T)为1:50时,rOMP10处理组的T淋巴细胞增殖效率最高。综上所述,本研究首次证实布鲁氏菌OMP10能够诱导BMDC的活化,促进抗原递呈分子的转录,从而介导T淋巴细胞的高效增殖,该结果为解析布鲁氏菌感染与宿主免疫机制奠定实验基础,同时也为布鲁氏菌新型亚单位疫苗研发提供数据支持。

STAT6介导的巨噬细胞极化对布鲁氏菌胞内存活的影响

旨在探讨STAT6介导的巨噬细胞极化对布鲁氏菌胞内生存的影响。本研究采用布鲁氏菌光滑株S2308(S2308)和粗糙型疫苗株RB51(RB51)侵染巨噬细胞。利用qRT-PCR检测M1型巨噬细胞标志因子p65、NOS2和IL-1β,M2型巨噬细胞标志因子STAT6、ARG1、IL-10的mRNA表达水平;流式细胞术检测M1型标记分子CD86和M2型标记分子CD206的表达;Western blot检测p-STAT6蛋白及抑制剂AS对蛋白的抑制作用;ELISA检测M1型细胞因子TNF-α、IL-12和M2型细胞因子IL-4、IL-10的表达量;最后对胞内菌落进行CFU计数。qRT-PCR结果显示,在感染8、12 h时可显著诱导M1型因子mRNA转录表达,72 h时低表达,而M2型因子在72 h时高表达;流式细胞术结果显示,S2308感染12 h可显著诱导CD86的表达,感染72 h可显著诱导CD206的表达,但RB51对二者无影响;Western blot结果显示,S2308菌株在感染72 h时激活STAT6信号通路,而RB51几乎不激活该通路,抑制剂AS在2μmol·L^(-1)浓度时抑制效果最佳;ELISA结果显示,AS抑制剂可显著抑制IL-4、IL-10的释放,并促进TNF-α、IL-12的释放;CFU计数结果显示,S2308组的胞内菌呈先降低后显著上升趋势,加入AS抑制剂后可显著抑制布鲁氏菌胞内复制。布鲁氏菌S2308在感染后期能够通过STAT6诱导M1型巨噬细胞向M2型转化,并促进Th2型细胞因子的释放,从而有利于布鲁氏菌的胞内生存。而RB51几乎不激活该通路,不影响胞内生存。

牛种布鲁氏菌A19 VirB启动子缺失株的构建及其生物学特性研究

为探究VirB基因对牛种布鲁氏菌A19株毒力的影响,深入了解布鲁氏菌胞内存活的机制,本研究以牛种布鲁氏菌A19株为模板,利用VirB基因的上下游同源臂融合kana抗性基因构建自杀质粒。以瞬间电击的方式,将自杀质粒电转进菌体,利用同源重组将VirB启动子用kana基因替换,构建A19ΔVirB缺失株。通过实时荧光定量PCR检测缺失株VirB相关蛋白的转录水平,并对缺失株的生长曲线、体外应激、黏附侵袭及胞内生存进行分析。结果显示,试验成功构建A19ΔVirB缺失株。实时荧光定量PCR结果显示,缺失株VirB相关蛋白的表达量极显著低于A19株(P<0.01),其生长曲线虽然不同于亲本株,但生长趋势相同。体外应激结果显示,A19株和A19ΔVirB株热休克应激没有明显变化,但在强酸、强碱、高盐的刺激下,A19株的存活率显著高于A19ΔVirB株(P<0.05)。黏附侵袭结果显示,缺失株对巨噬细胞的黏附侵袭能力近似于亲本株。胞内生存结果显示,随着时间的延长,A19株的胞内存活趋势逐渐上升,而缺失株A19ΔVirB总体趋势逐渐下降并且与A19的差距越来越大。综上所述,本研究成功构建了VirB启动子缺失株,极显著降低了相关蛋白的表达,为后续相关缺失株的构建及布鲁氏菌毒力的研究奠定基础。

布鲁氏菌DnaK基因缺失株的构建及其功能初步评价

为获得毒力较弱并能够区分自然感染和疫苗免疫的布鲁氏菌候选疫苗株,本研究采用PCR方法扩增布鲁氏菌疫苗株DnaK基因上下游同源臂序列及卡那基因序列,并利用融合PCR将以上基因序列融合,构建p DM18-T-ΔDnaK-Kana打靶载体。电转化至布鲁氏菌M5-90感受态细胞,筛选该菌疫苗株M5-90的DnaK基因缺失株,并对获得的M5-90ΔDnaK遗传稳定性、生长曲线、毒力和细胞免疫指标进行检测。结果表明,M5-90ΔDnaK与M5-90体外生长曲线相似, M5-90ΔDnaK在胞内的存活能力显著低于M5-90 (p<0.05), M5-90和M5-90ΔDnaK诱导小鼠血清IFN-γ水平相似(p>0.05),并且均显著高于PBS组(p<0.01)。结果表明,M5-90ΔDnaK有望成为毒力低且可诱导机体细胞免疫的疫苗候选株。本研究为布鲁氏菌致病机制的研究和疫苗的研发提供科学依据。

泛素相关修饰蛋白SUMO-2对RAW264.7细胞内布鲁氏菌16M存活的影响

为探究泛素相关修饰蛋白SUMO-2对布鲁氏菌16M的影响,本试验构建了SUMO-2基因干扰和过表达小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,并用布鲁氏菌16M进行侵染。参照GenBank中SUMO-2基因序列设计特异性干扰片段和过表达引物,克隆成功后连接至相应的慢病毒载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,选取阳性克隆菌提取质粒转染HEK-293FT细胞,将重组的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用布鲁氏菌16M分别侵染构建成功的干扰和过表达细胞模型。通过实时荧光定量PCR检测SUMO-2 mRNA的转录水平,Western blotting检测SUMO-2蛋白的表达,ELISA检测IFN-γ和TNF-α水平,菌落计数来确定布鲁氏菌在细胞中的存活能力。结果显示,与对照组相比,干扰组SUMO-2 mRNA水平极显著降低(P<0.01),过表达组SUMO-2 mRNA水平极显著升高(P<0.01),成功构建了SUMO-2干扰和过表达细胞模型。Western blotting结果显示,布鲁氏菌16M感染能以时间依赖的方式下调SUMO-2蛋白的表达。经菌落计数后发现,SUMO-2过表达后布鲁氏菌的数量极显著减少(P<0.01),抑制布鲁氏菌16M的细胞内繁殖。而SUMO-2干扰后布鲁氏菌的数量显著或极显著增加(P<0.05;P<0.01),促进布鲁氏菌16M的细胞内繁殖。同时,经SUMO-2过表达后,IFN-γ和TNF-α水平极显著升高(P<0.01)。经SUMO-2干扰后,TNF-α水平显著降低(P<0.05),IFN-γ水平极显著降低(P<0.01),SUMO-2在RAW264.7细胞中的表达变化也影响IFN-γ和TNF-α的产生。综上所述,SUMO-2蛋白在布鲁氏菌胞内存活中起着重要作用,可能有助于阐明布鲁氏菌感染的致病机制。

布鲁氏菌BspG基因缺失对其部分生物学活性影响的研究

为探究布鲁氏菌BspG基因在布鲁氏菌胞内循环感染中的作用,本研究利用PCR方法扩增流产布鲁氏菌(Brucella abortus)2308株BspG基因上、下游同源臂及卡那基因片段,利用融合PCR将上述3个基因片段融合后克隆至pMD19-T载体中构建重组质粒pMD19-BspG-Kan;同时从B. abortus 2308株中扩增BspG基因并克隆至pBBR1MCS-4载体中,构建重组质粒pBBR1MCS-4-BspG。上述两种质粒均经PCR及测序鉴定。将pMD19-BspGKan电转化至B. abortus 2308株中,24 h后利用Kan筛选BspG基因缺失株(ΔBspG),并经PCR鉴定;将pBBR1MCS-4-BspG转化ΔBspG菌株,经Kan+、AMP+抗性平板筛选BspG基因回补株(pBspG),并经PCR及测序鉴定。将上述两株菌连续传15代后分别利用PCR方法鉴定其的遗传稳定性;通过检测不同培养时间点的OD600nm值并绘制生长曲线分析上述两株菌与亲本菌株的生长特性;按照MOI 100将ΔBspG、pBspG和亲本株分别感染RAW 264.7细胞后不同时间,通过检测细胞内的细菌数量分析各菌株的粘附与侵袭能力(感染后15 min、30 min、45 min、60 min)和胞内生存能力(感染后4 h、8 h、12 h、24 h、48 h)。PCR鉴定结果显示,分别获得了基因缺失株ΔBspG和回补株pBspG且这两株菌分别传至15代后均未出现回复突变现象,表明ΔBspG和pBspG的遗传稳定性均较强;生长曲线结果显示,ΔBspG和pBspG的体外生长趋势明显慢于亲本株;粘附与侵袭力试验结果显示,侵染巨噬细胞1 h内,ΔBspG和pBspG的胞内存活数均与亲本株无显著差异,表明敲除Bsp G不影响细菌的粘附与侵袭能力;侵染巨噬细胞24 h内,ΔBsp G与亲本株的胞内活菌数无显著差异(P>0.05),而24 h后ΔBsp G的胞内活菌数极显著低于亲本株(P<0.01)。本研究结果首次表明BspG基因缺失降低了布鲁氏菌的胞内增殖能力,为研究BspG基因在布鲁氏菌致病机理中的作用奠定基础。