体外研究己糖激酶Ⅱ在缺血缺氧小鼠心肌细胞自噬流变化中的作用

目的探讨己糖激酶Ⅱ在体外培养的缺血缺氧小鼠心肌细胞自噬流变化中的作用。方法取6只1~2 d龄雌雄不限C57BL/6小鼠,分离心脏并培养原代心肌细胞,取原代细胞进行以下实验。(1)按照随机数字表法(分组方法下同)将细胞分为6组,即正常对照3、6、9 h组及缺血缺氧3、6、9 h组,每组4孔。DMEM/F12培养基常规培养(常规培养条件下同)48 h后,正常对照3、6、9 h组更换新鲜DMEM/F12培养基分别培养3、6、9 h,缺血缺氧3、6、9 h组更换无糖无血清培养基后于37℃含体积分数1%氧气、体积分数5%二氧化碳的低氧培养箱(缺氧培养条件下同)内分别培养3、6、9 h。细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞活力。(2)细胞分组及处理同实验(1),每组1孔。蛋白质印迹法检测细胞微管相关蛋白1轻链3 Ⅰ(LC3 Ⅰ)、LC3 Ⅱ、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达。(3)将细胞分为正常对照组、单纯缺血缺氧9 h组和缺血缺氧9 h+2-脱氧葡萄糖(2-DG)组,每组4孔。常规培养48 h后,正常对照组更换新鲜DMEM/F12培养基培养9 h;单纯缺血缺氧9 h组更换无糖无血清培养基,缺血缺氧9 h+2-DG组更换溶有物质的量浓度为10 mmol/L 2-DG(20 μmol)的无糖无血清培养基,2组均缺氧培养9 h。CCK-8法检测细胞活力。(4)细胞分组及处理同实验(3),每组1孔。蛋白质印迹法检测细胞LC3 Ⅰ、LC3Ⅱ和p62蛋白表达。(5)细胞分组及处理同实验(3),每组2孔。透射电镜下观察心肌细胞中自噬体/自噬溶酶体情况。(6)将细胞分为正常对照组、单纯缺血缺氧9 h组、缺血缺氧9 h+己糖激酶Ⅱ小干扰RNA1(HK-ⅡsiRNA1)组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组,每组4孔。正常对照组和单纯缺血缺氧9 h组常规培养48 h,缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组分别转染200 nmol/L HK-ⅡsiRNA1和HK-ⅡsiRNA2后常规培养48 h。正常对照组更换新鲜DMEM/F12培养基培养9 h,单纯缺血缺氧9 h组、缺血缺氧9 h+HK-Ⅱ siRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组更换无糖无血清培养基后缺氧培养9 h。CCK-8法检测细胞活力。(7)细胞分组及处理同实验(6),每组1孔。蛋白质印迹法检测细胞LC3 Ⅰ、LC3Ⅱ、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达。除实验(5)外,各实验均重复3次。对数据行单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正。结果(1)缺血缺氧3、6、9 h组心肌细胞活力分别为0.450±0.022、0.385±0.010、0.335±0.015,分别明显低于对应正常对照3、6、9 h组的0.662±0.026、0.656 ±0.028、0.661±0.021(t=6.21、9.12、12.48,P<0.01)。(2)与对应正常对照3、6、9 h组比较,缺血缺氧3、6、9 h组心肌细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达均显著增加(t3h=16.15、10.99、5.30,t6 h=6.79、10.42、9.42,t9h=15.76、16.51、7.20,P<0.05或P<0.01)。(3)单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞活力为0.353±0.022,较正常对照组的0.673 ±0.027明显降低(t=9.29,P<0.01);缺血缺氧9 h+2-DG组心肌细胞活力为0.472 ±0.025,较单纯缺血缺氧9 h组明显升高(t=3.60,P<0.05)。(4)与正常对照组比较,单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ比值及p62蛋白表达均明显增加(t=9.45、8.40,P<0.01);与单纯缺血缺氧9 h组比较,缺血缺氧9 h+2-DG组心肌细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ比值及p62蛋白表达均明显减少(t=4.39、4.74,P<0.05)。(5)正常对照组心肌细胞中仅可见个别双层膜结构的自噬体/自噬溶酶体;与正常对照组比较,单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞中双层膜结构的自噬体/自噬溶酶体明显增多;与单纯缺血缺氧9 h组比较,缺血缺氧9 h+2-DG组心肌细胞中自噬体/自噬溶酶体数量明显减少。(6)单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞活力为0.358±0.023,较正常对照组的0.673 ±0.026明显降低(t=9.12,P<0.01);缺血缺氧9 h+HK-Ⅱ siRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-Ⅱ siRNA2组心肌细胞活力分别为0.487 ±0.027、0.493±0.022,较单纯缺血缺氧9 h组明显升高(t=3.63、4.28,P<0.05)。(7)与正常对照组比较,单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ比值、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达均明显增加(t=6.08、6.31、4.83,P<0.05或P<0.01);与单纯缺血缺氧9 h组比较,缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组心肌细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达均明显减少(t=5.10、7.76、15.33,4.17、8.42、12.11,P<0.05或P<0.01)。结论缺血缺氧上调体外培养的小鼠心肌细胞己糖激酶Ⅱ蛋白表达水平,通过损害自噬流导致心肌细胞活力下降;抑制己糖激酶Ⅱ活性或其表达可减轻心肌细胞缺血缺氧损害。

体外研究小鼠心肌细胞自噬过程中人抗原R对溶酶体酸化的作用

目的探讨人抗原R在体外培养的小鼠心肌细胞自噬过程中对溶酶体酸化的作用。方法取1~2d龄C57BL/6小鼠(雌雄不限)20只,分离心脏培养原代心肌细胞,进行以下实验。(1)采用随机数字表法(分组方法下同)将细胞分为5组,即正常对照组和无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0h组。正常对照组用DMEM/F12培养基常规培养(常规培养条件下同)54.0h,无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0h组常规培养53.5、53.0、51.0、48.0h后更换无糖无血清培养基分别处理0.5、1.0、3.0、6.0h,蛋白质印迹法检测细胞总蛋白中微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、自噬相关蛋白5、腺苷三磷酸酶V1区E1亚基(ATP6V1E1)蛋白表达。(2)将细胞分为正常对照组和无糖无血清3.0h组,相应各组细胞处理同实验(1),激光扫描共聚焦显微镜下观测细胞溶酶体酸化水平。(3)取2个批次细胞,均同实验(1)分组处理,蛋白质印迹法检测一个批次细胞总蛋白及另一个批次细胞胞质、胞核蛋白中人抗原R蛋白表达。(4)将细胞分为正常对照组、单纯对照小干扰RNA(siRNA)组、单纯人抗原R-siRNA1(HuR-siRNA1)组、单纯HuR-siRNA2组、无糖无血清3.0h组、无糖无血清+对照siRNA组、无糖无血清+HuR-siRNA1组、无糖无血清+HuR-siRNA2组。常规培养48h后,单纯对照siRNA组及无糖无血清+对照siRNA组加入阴性对照siRNA、单纯HuR-siRNA1组及无糖无血清+HuR-siRNA1组加入HuR-siRNA1、单纯HuR-siRNA2组及无糖无血清+HuR-siRNA2组加入HuR-siRNA2转染6h,8组均继续常规培养48h后,正常对照组及各单纯siRNA处理组更换DMEM/F12培养基、其余各组更换无糖无血清培养基培养3h,蛋白质印迹法检测细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达。(5)取2个批次细胞,均分为无糖无血清+对照siRNA组、无糖无血清+HuR-siRNA1组,相应各组细胞处理同实验(4),免疫荧光法观测一个批次细胞人抗原R分布及表达,激光扫描共聚焦显微镜下观测另一批次细胞溶酶体酸化水平。(6)取3个批次细胞,均分为无糖无血清3.0h组、无糖无血清+对照siRNA组、无糖无血清+HuR-siRNA1组、无糖无血清+HuR-siRNA2组,相应各组细胞处理同实验(4),蛋白质印迹法检测一个批次细胞总蛋白中组织蛋白酶D、一个批次细胞胞质蛋白中人抗原R及另一个批次细胞总蛋白中ATP6V1E1蛋白表达。(7)将细胞分为正常对照组、无糖无血清3.0h组、无糖无血清+对照siRNA组、无糖无血清+HuR-siRNA1组,相应各组细胞处理同实验(4),实时荧光定量反转录PCR法检测细胞ATP6V1E1mRNA表达。各实验样本数均为3。对数据进行独立样本t检验、单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正。结果(1)与正常对照组比较,无糖无血清1.0、3.0、6.0h组细胞总蛋白中LC3Ⅱ、ATP6V1E1蛋白表达显著增加(t=12.16、4.05、4.82,11.64、3.29、8.37,P<0.05或P<0.01),无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0h组细胞总蛋白中自噬相关蛋白5蛋白表达显著增加(t=6.88、10.56、5.76、9.91,P<0.05或P<0.01)。(2)与正常对照组的1.03±0.08比较,无糖无血清3.0h组细胞溶酶体酸化水平(2.92±0.30)明显升高(t=6.01,P<0.01)。(3)5组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达组间总体比较,差异无统计学意义(F=1.09,P>0.05)。与正常对照组比较,无糖无血清1.0、3.0、6.0h组细胞胞质蛋白中人抗原R蛋白表达显著增加(t=43.05、11.07、5.39,P<0.05或P<0.01),无糖无血清3.0、6.0h组细胞胞核蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少(t=11.18、12.71,P<0.01)。(4)与单纯对照siRNA组比较,单纯HuR-siRNA1组、单纯HuR-siRNA2组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少(t=4.82、4.44,P<0.05)。与无糖无血清+对照siRNA组比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组、无糖无血清+HuR-siRNA2组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少(t=4.39、6.27,P<0.05)。(5)与无糖无血清+对照siRNA组比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组细胞胞质中人抗原R分布减少、表达水平显著降低(t=10.13,P<0.01)。与无糖无血清+对照siRNA组的1.00±0.06比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组细胞溶酶体酸化水平(0.73±0.06)显著下降(t=3.28,P<0.01)。(6)与无糖无血清+对照siRNA组比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组、无糖无血清+HuR-siRNA2组细胞总蛋白中组织蛋白酶D、胞质蛋白中人抗原R、总蛋白中ATP6V1E1蛋白表达均显著减少(t=4.16、3.99,4.81、5.07,11.68、12.97,P<0.05或P<0.01)。(7)与正常对照组比较,无糖无血清3.0h组细胞中ATP6V1E1mRNA表达显著增加(t=5.51,P<0.05)。与无糖无血清+对照siRNA组比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组细胞中ATP6V1E1mRNA表达显著减少(t=5.97,P<0.05)。结论小鼠原代心肌细胞在体外无糖无血清处理后自噬激活、溶酶体酸化增强、胞质中人抗原R表达增加,人抗原R功能激活并参与维持小鼠心肌细胞自噬过程中的溶酶体酸化。