人子宫内膜异位症异位腺上皮永生化细胞系的建立

目的:建立人子宫内膜异位症(EMs)的异位腺上皮永生化细胞系,为进一步深入研究EMs奠定基础。方法:取人EMs异位病灶组织进行原代培养,用质粒PCD2SV40T转染原代细胞,G418筛选14天后获得抗性克隆。将抗性克隆传代培养,用免疫细胞化学、RT-PCR、细胞计数、核型分析及裸鼠成瘤实验等对细胞系进行鉴定。结果:建立了一株传代超过50代的永生化细胞系,命名为hEM5B2。该细胞系具有腺上皮细胞形态,细胞角蛋白与波形蛋白阳性,抗成纤维细胞抗体阴性,雌激素受体α和β亚型(ER-α,ER-β)及孕激素受体(PR)阳性,细胞倍增时间64.8h。核型分析显示,染色体众数为78～123,为多倍体核型;观察1个月裸鼠成瘤实验显示未成瘤。结论:hEM5B2细胞系是一株人EMs异位腺上皮永生化细胞系,可作为细胞模型用于EMs的体外实验研究。

人子宫内膜异位症患者在位内膜间质细胞永生化细胞系的建立及鉴定

目的建立人子宫内膜异位症(Endometriosis,EMs)患者在位内膜间质细胞永生化细胞系。方法将原代培养的EMs患者在位内膜间质细胞转染质粒PCD2SV40T,G418筛选并进行单克隆细胞挑选,采用核型分析、免疫细胞化学、RT-PCR、裸鼠成瘤实验等方法对传代培养后的抗性单克隆细胞进行鉴定。结果首次建立了EMs患者在位内膜间质细胞永生化细胞系hEM15A,该细胞系具有子宫内膜间质细胞特征,可连续传代,表现为正常二倍体核型,未观察到致瘤性。结论 hEM15A细胞系易获得、培养难度小、细胞均一性高、存活时间长,可成为EMs的研究工作中实用的体外模型。

普伐他汀对子痫前期样小鼠模型中长链脂肪酸氧化酶的调节作用

目的探讨普伐他汀（Pra）对子痫前期（PE）样小鼠模型中长链3-羟基酰基辅酶A脱氢酶（LCHAD）的调节作用。方法将32只C57BL／6J小鼠随机于孕7—18d每天注射亚硝基左旋精氨酸甲酯以建立PE样模型（即PE），或同期注射等剂量生理盐水为正常对照（即Con），再分别于孕8d始每天Pra灌胃（PE＋Pra、Con＋Pra组）或生理盐水灌胃（PE＋N、Con＋N组）；孕鼠共4组，每组各8只。于孕18d时收集孕鼠的肝脏及胎盘组织。通过蛋白印迹法、实时荧光定量PCR技术、免疫组化法检测，并比较LCHAD在各组孕鼠肝脏及胎盘中的表达。结果（1）PE＋N组孕鼠的动脉压自孕8d至孕18d逐渐升高，而PE＋Pra组孕鼠自孕10d始开始下降；PE＋N组孕鼠孕18d时的24h尿蛋白量[（1494±201）μg]明显高于Con＋N组[（935±128）μg]，两组比较，差异有统计学意义，（P〈0．01），也明显高于PE＋Pra组孕鼠[（981±116）μg，P〈0．01]。（2）蛋白印迹法：PE＋N组孕鼠的肝脏及胎盘LCHAD蛋白的表达水平（肝脏：0．64±0．11，胎盘：0．48±0．06）明显低于Con＋N组（肝脏：1．06±0．10，胎盘：0．60±0．10；P均〈0．01），也明显低于PE＋Pra组（肝脏：0．99±0．04，胎盘：0．60±0．08；P均〈0．01）。（3）实时荧光定量PCR技术：PE＋N组孕鼠的肝脏及胎盘LCHADmRNA的表达水平（肝脏：0．621±O．128，胎盘：0．646±0．129）明显低于Con＋N组（肝脏：1.007±0．130，胎盘：1．004±0．103；P均〈0．01），而与PE＋Pra组（肝脏：0．693±0．678，胎盘：0．662±0．183）比较，差异无统计学意义（P均〉0．05）。（4）免疫组化法：4组孕鼠肝脏组织中均有LCHAD蛋白的广泛表达，在胎盘组织中以迷路滋养层绒毛干外层绒毛滋养细胞及合体滋养细胞中表达最多。LCHAD蛋白在PE＋N组孕鼠的表达水平（肝脏：0．062±0．016，胎盘：0．147±0．018）明显低于Con＋N组（肝脏：0．126±0．013，胎盘：0．183±0．024；P均〈0．05），也明显低于PE＋Pra组（肝脏：0．111±0．017，胎盘：0．174±0．027；P均〈0．05）。结论Pra可上调PE样模型孕鼠肝脏及胎盘LCHAD蛋白的表达水平，其可能为调节PE临床表现的机制。

不同途径建立的子痫前期模型孕鼠胎盘组织中LCHAD基因位点甲基化水平的差异性研究

目的 通过检测不同诱发途径建立的子痫前期模型孕鼠胎盘组织中长链脂肪酸β氧化关键酶长链-3-羟酰基辅酶A脱氢酶（LCHAD）基因位点甲基化程度的差异,探讨多因素和多通路在子痫前期病理机制中的分子实验基础.方法 按不同途径建立子痫前期孕鼠模型并分组如下：（1）左硝基精氨酸甲酯（L-NAME）组：给予孕鼠皮下注射L-NAME的方法建模;（2）脂多糖（LPS）组：给予孕鼠腹腔注射LPS的方法建模;（3）载脂蛋白C3（ApoC3）组：给予存在脂代谢障碍的孕鼠皮下注射L-NAME的方法建模型;（4）β2糖蛋白Ⅰ（β-2GPI）组：给予孕鼠皮下注射β-2GPI不完全弗氏佐剂的方法建模.根据建模时间对L-NAME组、LPS组及ApoC3组孕鼠于妊娠第3、11、16天分别定为胚胎植入前期、子痫前期早发期和晚发期3个不同实验阶段,β-2GPI组孕鼠仅有植入前期,对不同实验阶段的孕鼠胎盘LCHAD基因位点的甲基化水平进行检测.同时设生理盐水对照组,以及应用ApoC3高表达转基因孕鼠作为对照的转基因对照组.结果 （1）各组孕鼠LCHAD基因发生甲基化的位点：在LCHAD基因转录起始位点上游728 bp的范围内,共发现存在45个CG位点,其中LCHAD基因CG-5、12、13、14、15、16、19、24、25、27、28、29、30、31、32、34、35、43为含有2个及以上CG序列的复合位点,其他位点为仅含有1个CG序列的单一位点.L-NAME组、LPS组、ApoC3组和β-2GPI组孕鼠均有13个LCHAD基因位点发生甲基化改变,其中,LCHAD基因CG-3、5、6、11、13、14、18、28位点呈不同程度的高甲基化状态;LCHAD基因CG-16、25、31、42、44位点呈不同程度的低甲基化状态;其余32个位点无甲基化改变.（2）各组孕鼠胎盘LCHAD基因位点甲基化水平比较：L-NAME组、LPS组、ApoC3组、β-2GPI组和转基因对照组孕鼠胎盘LCHAD基因CG-3、11、13、14、18位点的甲基化水平显著高于生理盐水对照组,分别比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）;而LCHAD基因CG-42、44位点的甲基化水平显著低于生理盐水对照组,分别比较,差异有统计学意义（P〈0.05）.（3）各组孕鼠LCHAD基因相同位点的甲基化水平比较：①L-NAME组孕鼠早发期LCHAD基因CG-3、11、18位点的甲基化水平显著低于植入前期及晚发期,LPS组孕鼠植入前期显著低于早发期及晚发期;而ApoC3组孕鼠植入前显著高于早发期及晚发期,分别比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）.②L-NAME组、LPS组不同实验阶段孕鼠LCHAD基因CG-5位点甲基化水平均显著高于生理盐水对照组,而ApoC3组仅植入前及早发期高于生理盐水对照组,分别比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）.③L-NAME组孕鼠不同实验阶段LCHAD基因CG-6位点甲基化水平显著高于其他各组,分别比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）.④L-NAME组孕鼠LCHAD基因CG-13、14位点甲基化水平在植入前、早发期、晚发期呈逐渐升高趋势,LPS组孕鼠在植入前显著高于早发期、晚发期,而ApoC3组孕鼠早发期的甲基化水平最高,分别比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）.⑤L-NAME组孕鼠LCHAD基因CG-28位点甲基化水平在植入前、早发期、晚发期呈逐渐降低趋势,LPS组孕鼠早发期、晚发期甲基化水平高于植入前期,ApoC3组孕鼠早发期甲基化水平最高,分别比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）.⑥ApoC3组孕鼠LCHAD基因CG-16、25、31位点甲基化水平显著高于其他各组,分别比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）.⑦β-2GPI组孕鼠LCHAD基因CG-42位点未检测到甲基化,而其他各组CG-42位点呈低甲基化状态,β-2GPI组与其他各组的CG-42位点甲基化水平比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）.结论 LCHAD基因CG-6、42位点甲基化可能分别与L-NAME、β-2GPI诱导的子痫前期孕鼠胎盘中LCHAD基因表达变化相关;LCHAD基因表达和甲基化在LPS和ApoC3转基因孕鼠中未见明显联系.不同诱发途径的子痫前期孕鼠LCHAD甲基化水平和表达存在的差异,进一步揭示了多因素和多通路在子痫前期发病机制中的分子实验基础.

普伐他汀对子痫前期样小鼠模型中Rheb表达的影响

目的观察普伐他汀(Pra)干预的子痫前期(PE)样小鼠模型中脑Ras同源蛋白(Rheb)的表达变化,探讨Pra对子痫前期样小鼠模型中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的抑制是否通过Rheb调节。方法将C57BL/6J孕鼠随机分组,于妊娠7~18 d每天注射亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)建立PE样模型,并设立生理盐水对照(Con);于妊娠第8天起再分别每天给予Pra(PE+Pra组、Con+Pra组)或生理盐水(PE+N组、Con+N组),每组8只。于妊娠18 d收集孕鼠的肝脏及胎盘组织;采用蛋白印迹法、实时荧光定量PCR技术和免疫组化法检测组织中Rheb基因和蛋白的表达水平,并比较各组孕鼠肝脏及胎盘组织中Rheb的表达水平变化。结果(1)蛋白印迹法检测结果:PE+N组(肝脏:0.706±0.123;胎盘:0.866±0.128)及Con+N组(肝脏:0.732±0.123;胎盘:0.909±0.097)孕鼠的肝脏和胎盘组织中Rheb蛋白的表达水平,分别比较,差异均无统计学意义(P均>0.05);PE+Pra组(肝脏:0.669±0.134;胎盘:0.940±0.221)与PE+N组孕鼠比较,差异也均无统计学意义(P均>0.05)。(2)实时荧光定量PCR检测结果:PE+N组(肝脏:1.026±0.480;胎盘:1.102±0.361)与Con+N组(肝脏:1.058±0.389;胎盘:1.067±0.400)孕鼠的肝脏和胎盘组织中Rheb mRNA的表达水平,分别比较,差异均无统计学意义(P均>0.05);PE+Pra组(肝脏:0.735±0.356;胎盘:0.822±0.304)与PE+N组比较,差异也均无统计学意义(P均>0.05)。(3)免疫组化结果:Rheb蛋白在各组孕鼠肝脏和胎盘组织的表达部位无明显差异,PE+N组与Con+N组、PE+Pra组与PE+N组的Rheb蛋白表达水平分别比较,差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论Pra在PE样小鼠模型中抑制mTOR信号通路的作用,可能与Rheb基因和蛋白的表达水平无关。

长链脂肪酸氧化酶在妊娠中期子痫前期样母鼠和胎鼠组织中的表达

目的 探讨长链脂肪酸氧化酶LCHAD在妊娠中期子痫前期样改变母鼠和胎鼠组织中的蛋白表达及分布.方法 将C57BL/6J孕鼠于孕1id皮下注射一氧化氮合酶抑制剂建立子痫前期样模型,同时设立注射生理盐水的正常妊娠对照组,模型鉴定成功后,于孕14 d进行标本取材.采用免疫组化方法检测母鼠及胎鼠组织中LCHAD蛋白的分布和表达状况.结果 孕14 d实验组平均动脉压（115.6±3.3）mmHg（1 mmHg =0.133 kPa）和尿蛋白（97.0±4.3）μg·g体质量^-1·24h^-1较对照组平均动脉压（96.2±4.9）mmHg和尿蛋白（60.8 ±4.9） μg·g体质量^-1·24 h^-1显著升高（P＜0.05）.在两组动物中均可见到母鼠肝、肾、心、胎盘组织中LCHAD蛋白呈阳性表达,实验组母体肝、胎盘LCHAD的IA值强度较对照组明显降低（P＜0.05）.胎鼠的肝、肾、心、肺和神经视网膜组织中,两组均有LCHAD表达,但IA值差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 妊娠中期LCHAD蛋白在母鼠和胎鼠重要器官均广泛表达分布,在妊娠期LCHAD与母体能量代谢、胎盘的发育及胎儿生长发育有关;子痫前期样改变时母体肝脏和胎盘的LCHAD表达存在异常.