奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌和大肠杆菌二重PCR检测方法的建立

金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌。选取金黄色葡萄球菌的Nuc基因和大肠杆菌16S-23SrRNA基因作为扩增靶基因序列,设计两对特异性引物。通过正交试验优化反应条件建立二重PCR检测体系,优化结果表明二重PCR扩增出两条特异性条带,大小与实验设计的249bp(金黄色葡萄球菌)和375bp(大肠杆菌)相符,而对其它奶牛乳房炎主要病原菌的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该二重PCR技术能同时检出14.6pg的金黄色葡萄球菌模板和26.0pg的大肠杆菌模板。使用该二重PCR检测29份临床奶样,发现其中17份携带相关基因,并分离得到相关致病菌。

山羊Th1/Th2细胞因子实时荧光定量检测方法的建立

目的在mRNA水平对山羊Th1/Th2型细胞因子进行定量分析,建立山羊Th1/Th2型细胞因子实时荧光定量检测方法。方法根据GenBank山羊Th1(IL-2和IFN-γ)和Th2(IL-4、IL-6和IL-10)细胞因子基因保守序列设计引物,以标准阳性质粒为模板分别进行荧光定量PCR反应的标准曲线、溶解曲线建立。结果山羊Th1/Th2细胞因子实时荧光定量检测方法Ct值与标准品呈良好的线性关系,R^2均大于0.985,所有稀释度标准品模板出现特异性熔解峰;利用N1蛋白缺失的重组山羊痘病毒(△N1L株)与山羊痘AV41株感染山羊外周血淋巴细胞进行IL-4和IFN-γmRNA表达水平检测,△N1L株与山羊痘AV41株均能能够刺激机体IL-4和IFN-γ细胞因子,但二者差异无统计学意义(t=3.333,P>0.5)。结论本研究建立山羊Th1/Th2细胞因子实时荧光定量检测,为山羊痘基因工程疫苗的研究奠定基础。

牛乳头瘤病毒基因1型广西GX01流行株全基因组克隆及序列分析

为了解牛乳头瘤病毒1型(bovine papillomavirus genotype 1,BPV-1)广西GX01株全基因组序列、结构特征及遗传变异情况,同时了解该毒株引起宿主产生的病理组织学变化情况,本研究选取广西贺州市患病牛皮肤肿瘤样物制作石蜡切片后镜检观察,提取病料DNA,以乳头瘤病毒L1基因的简并引物FAP59/FAP64进行PCR扩增以确定此病毒的基因型,根据GenBank中BPV参考株设计嵌套引物,对GX01株进行全基因组扩增、克隆测序及序列分析。病理组织学检查结果显示,可在病变部位发现表皮细胞增生、肿胀,角质过度及挖空细胞等乳头瘤病毒感染的特征性病变。序列分析结果表明,GX01株为BPV-1,其全基因组长为7 945bp,包含E1、E2、E4、E5、E6、E7、L1、L2 8个开放阅读框,符合BPV-1型基因组的结构特征;GX01与BPV-1参考株全基因组核苷酸序列同源性为98.6%~99.6%,与BPV-2型参考株(M20219.1)、BPV-13型参考株(JQ798171.1)同源性分别为86.9%和87.2%。GX01株为广西地区首次经检测确认并测定全基因组序列的牛乳头瘤病毒。本研究为广西地区乃至全国的牛乳头状瘤的病原鉴定、流行规律、遗传变异、疫源追溯及科学防控提供了基础数据。

犬圆环病毒Cap蛋白的生物信息学分析及原核表达

犬圆环病毒(CanineCV)是近年被发现的圆环病毒属新成员,获取CaineCV Cap蛋白,为研究Cap蛋白的功能以及抗原表位奠定了基础。本研究以CaineCV GX2017株基因组作为模板,使用PCR方法扩增出Cap蛋白的基因序列,对其进行生物信息学分析,并克隆至pET-28a原,进行原核表达。结果表明:GX2017的N端2~26位氨基酸存在一个核定位信号,同时含有3个B细胞表位(aa7~aa14;aa150~aa174;aa233~aa253);第134位氨基酸为N-糖基化位点,第169和第238位氨基酸为O-型糖基化位点;进化分析表明,本研究的CanineCV Cap蛋白基因序列与欧美株同源性较低,且处在不同的分支;SDS-PAGE结果显示,重组Cap蛋白在E.coli BL21(DE3)中不能正确表达,切除了NLS的d(1-26)Cap蛋白能在E.coli BL21(DE3)中大量表达;Western blot 分析表明,该重组蛋白能与Anti-His 标签抗体发生特异性反应。本研究成功构建了pET-d(1-26)Cap重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中获得高水平表达,为进一步制备Cap蛋白的抗体奠定了基础。

山羊IL-1β IL-8和Mx1因子实时荧光定量检测方法的建立

根据GenBank羊炎性细胞因子(IL-1β和IL-8)和Mx1保守序列,设计特异性引物,利用SYBR Green I染料法建立实时荧光定量检测方法。将羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子基因保守区域克隆到pMD18-T载体,构建标准质粒。分别以标准质粒为模板建立荧光定量PCR反应的标准曲线、熔解曲线。结果表明,羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子实时荧光定量检测方法Ct值与标准品呈良好的线性关系,R^2均大于0.990,所有稀释度标准品模板出现特异性熔解峰。应用所建立的方法对山羊痘病毒AV41感染山羊外周血淋巴细胞中IL-1β、IL-8和Mx1 mRNA表达水平进行检测,山羊痘病毒AV41可以刺激机体产生较高的炎性细胞因子。建立的羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子荧光定量检测方法,可以为山羊痘病毒感染后分子免疫机制研究奠定基础。

犬圆环病毒病研究进展

自2012年美国首次报道犬圆环病毒(CanineCV)以来,随后欧洲、北美洲及亚洲等地区陆续从腹泻犬中发现该病毒。犬圆环病毒可感染不同年龄段犬,尤其以幼龄犬感染率较高。该病毒可以感染狼和獾等食肉动物,经常与犬细小病毒发生混合感染,造成犬的出血性腹泻。犬圆环病毒(CanineCV)与其他肠道病毒协同作用,加重胃肠道疾病。然而对于犬圆环病毒病的研究还没有完全深入,论文就目前已知犬圆环病毒病的病原特征与致病性、流行病学、诊断等方面的研究进展进行概述,为犬圆环病毒的研究提供参考。

羊凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1和TNF-α实时荧光定量检测方法的建立

为探讨羊痘病毒感染后机体的凋亡细胞因子mRNA表达水平的变化,深入探讨羊痘病毒免疫机制,本研究设计针对羊凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1和TNF-α特异性引物,建立羊凋亡细胞因子实时荧光定量方法。分别建立荧光定量PCR反应体系并进行优化。结果表明:Fas、FasL、TNFR1和TNF-α的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR各基因的溶解曲线均呈单一溶解峰。组内变异系数均小于2.00%。本研究建立的羊凋亡细胞因子SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法为凋亡细胞因子mRNA表达水平提供了技术平台。

重庆地区犬圆环病毒检测及序列分析

本试验旨在调查近年来新发的犬圆环病毒(canine circovirus,CCV)在重庆地区的流行情况,探索重庆流行毒株的特性。本研究利用PCR方法对2017年采集于重庆地区的100份犬血清样品进行CCV核酸检测,对所得CCV阳性样品进行全基因组扩增与测序,并利用MegAlign、Mega 6.0和RDP4等软件对分离到的重庆CCV毒株进行分析。结果显示,重庆地区100份犬血清中共有4份为CCV阳性,阳性率为4%,从4份阳性样品中共获得3株不同的CCV基因组(CQ76、CQ79和CQ82),全长基因组序列均为2062 nt,与此前报道长度为2063 nt的CCV基因组相比缺少了一个碱基,该碱基位于5′-基因间隔区内茎环结构的下游。3个毒株的两个ORF之间5′末端间隔区和3′末端间隔区长度分别为134(1929-2062 nt)和203 nt(913-1115 nt)。CQ76、CQ79和CQ82的同源性在99.8%~100%之间,其中CQ76与CQ82仅在第2019位点存在同义突变;所获得的3个重庆毒株与国内外报道的其他CCV基因组序列同源性为82.7%~97.1%,其中,ORF2的变异程度大于ORF1。基于病毒ORF2序列和全基因组分别构建NJ进化树中,CQ76、CQ79和CQ82均属于同一亚群,与属于基因Ⅱ型的中国毒株204株遗传距离较近,同源性为96.5%~96.7%。RDP4重组分析发现,CQ76、CQ79和CQ82毒株基因组均为广西毒株204株和388株的重组序列,重组区域坐落于ORF2。本研究为丰富CCV流行病学和遗传进化信息,以及进一步防控研究提供基础数据。

犬圆环病毒Rep蛋白的原核表达

犬圆环病毒(CanineCV)是一种新发现的圆环病毒。制备针对CaineCV Rep的抗体,为建立CaineCV ELISA检测方法及研究Rep蛋白的功能奠定基础。以CaineCV基因组作为模板,扩增出Rep基因序列。PCR产物克隆至pET-28a原核表达载体上,获得了重组质粒pET(28a)-Rep。将重组质粒转入大肠埃希菌BL21感受态细胞后进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明重组Rep蛋白在大肠埃希菌BL21中获得表达。Western blot分析表明,重组蛋白能与Anti-His标签抗体发生特异性反应。该研究构建了pET(28a)-Rep重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌中获得表达,为进一步制备Rep的抗体奠定了基础。

山羊Toll样受体基因TLR2和TLR4及TLR9的荧光定量PCR检测方法的建立

根据山羊Toll样受体（TLR2、TLR4和TLR9）及管家基因β-actin的保守序列设计特异性引物,分别建立不同的荧光定量PCR标准曲线及直线回归方程,并对方法的灵敏度、重复性和特异性进行检验。结果表明：山羊TLR2、TLR4、TLR9及管家基因β-actin的荧光定量RT-PCR标准曲线相关性R2大于0.984;特异性强,出现特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于2%。应用所建立的方法对N1蛋白缺失的重组山羊痘病毒（△N1L株）感染山羊外周血淋巴细胞TLR2和TLR9 mRNA表达水平进行了检测,△N1L株可以显著提高机体固有免疫应答水平。本研究建立的山羊天然免疫因子相关受体荧光定量PCR方法可应用于山羊痘新型基因工程疫苗的评价。

人乳头瘤病毒分型联合宫颈液基薄层细胞学检测在宫颈癌筛查中的应用

【目的】探讨第三代人乳头状瘤病毒核酸检测杂交捕获定量分型技术(DH3)分型检测人乳头瘤病毒(HPV)联合宫颈液基薄层细胞学检查(TCT)在宫颈癌筛查中的应用价值。【方法】选择2020年10月—2021年3月在广西医科大学第四附属医院柳州市工人医院进行HPV分型和TCT宫颈筛查的女性患者进行回顾性分析,共1 582例,以病理学检查结果为金标准,对结果进行分析比较。【结果】在1 582例患者中,HPV检测结果阳性334例,阴性1 248例;TCT检测结果阳性234例,阴性1 348例;病理学检查结果阳性180例,阴性1 402例。HPV分型联合TCT检测中,极度高危型和高危型HPV双重阳性检测结果与病理检查结果无差异,其他HPV单一分型阳性检测结果与病理检查结果有差异,分别检出TCT漏诊病例。HPV分型检测的灵敏度为100.0%,阳性预测值为53.9%,特异度为89.0%,阴性预测值为100.0%。HPV分型检测中,高危型HPV16和18的阳性预测值高达94.8%,其他12种高危型HPV的阳性预测值为73.8%,低级别鳞状上皮内病变诊断病例稍有偏差,高级别鳞状上皮内病变与鳞状上皮癌的诊断基本一致。【结论】HPV分型联合TCT筛查宫颈癌可降低单项检查的误诊率和漏诊率,HPV分型检测有助于对患者进行分层管理,对检查分流和级别筛查具有较高的临床应用价值。

猪源奇异变形杆菌的分离鉴定及其毒力的测定

为探究引起保育猪死亡的病原菌的生物学特性、耐药性及毒力,通过形态学观察、生理生化特性测定、16S rDNA基因序列分析、药敏试验、半数致死量测定对分离菌株进行鉴定。结果表明,分离菌株为奇异变形杆菌,16S rDNA基因进化树分析表明该分离菌株与来自印度海水中的分离菌株CIFRI P-TSB-13(JF784025)的亲缘关系最近;分离菌株对头孢西丁、头孢他啶、大观霉素、氨曲南这4种抗生素高度敏感,对米诺环素、呋喃妥因、阿米卡星等10种抗生素中度敏感,对庆大霉素、氧氟沙星、左氟沙星等21种抗生素不敏感,表明分离菌株具有多重耐药性。分离菌株感染斑马鱼的半数致死量为2.12×10~5CFU/mL,感染昆明小鼠的半数致死量为1.46×10~7CFU/mL。证实引起本次保育猪细菌感染的病原为奇异变形杆菌,且该分离菌株的毒力较强,建议治疗时应针对性地选择高敏抗菌药物。

高危型人乳头瘤病毒含量检测对宫颈上皮内瘤变筛查的意义

目的探讨三代杂交捕获定量分型技术(DH3)检测人乳头瘤病毒(HPV)含量联合宫颈液基薄层细胞检测(TCT)对宫颈上皮内瘤变筛查的作用。方法选择2019年11月至2021年3月于广西医科大学第四附属医院、柳州市工人医院病理科同时进行DH3和TCT宫颈筛查的女性患者4013例,以病理学检查结果为金标准,对结果进行比较分析。结果在4013例患者中,DH3检测阳性1666例,阴性2347例;TCT阳性1066例,阴性者2947例;病理学检查阳性237例,阴性1431例。DH3定量检测中,HPV含量高于10的病例与病理学检查高级别鳞状上皮内瘤变相符,低级别鳞状上皮内病变诊断病例上稍有偏差,多数病例HPV含量处于临界值。结论HPV病毒含量检测联合TCT筛查宫颈癌可以降低单项检查的误诊率和漏诊率,定量检测有助于对误诊和漏诊病例进行重新审查,对宫颈上皮内瘤变分流和级别筛查具有较高的临床意义。

宫颈细胞蜡块制作方法在宫颈病变筛查中的比较研究

目的比较三种不同的细胞蜡块制作方法在宫颈病变筛查中的作用,探索更好的宫颈细胞蜡块制作方法,提高诊断准确率,使患者在早期筛查中得到合理分流。方法收集柳州市工人医院2018年1月~12月妇科宫颈液基细胞学检测(TCT)剩余样本270例,其中炎症、低级别鳞状上皮内病变(LSIL)、高级别鳞状上皮内病变(HSIL),鳞状细胞癌(SCC)的病例,分别为148例、35例、72例、15例。将同一样本分为3份,分别用传统琼脂包埋法、琼脂温箱凝固包埋法、琼脂冷冻凝固包埋法进行细胞蜡块制备。比较三种方法制片效果、诊断阳性率及诊断的符合率。结果三种细胞蜡块制备方法对高级别以上病变筛查阳性率与TCT诊断结果比较,差异无统计学意义(P>0.05);传统琼脂包埋法的符合率较低,与另外两种琼脂包埋法比较,差异有统计学意义(P<0.05);琼脂温箱包埋法与琼脂冷冻包埋法诊断符合率较高,两者比较,差异无统计学意义(P>0.05);琼脂冷冻包埋法细胞更集中、平铺,制作简便。结论宫颈细胞蜡块制备可以辅助宫颈病变早期分流,琼脂冷冻包埋法是一种较好的宫颈细胞制备方法。