干热法对人血浆血管性假血友病因子冻干品中病毒灭活效果的观察

目的探讨干热灭活法(dry heat treatment)对血管性假血友病因子(von willebrand factor,v WF)中猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)和脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)的灭活效果。方法以PPV或EMCV作为灭活指示病毒与v WF混合,并分别在(80±1)℃4、8、12、24、36、48、72 h,(90±1)℃4、12、24、36、48 h以及(99±1)℃5、15、30 min进行干热灭活处理。将在干热灭活前以及干热灭活后不同温度时间段的v WF样品接种ST细胞(swine testis)或Vero细胞培养,观察细胞病变(cytopathic effect,CPE),用Reed-Muench法计算残余PPV和EMCV的病毒滴度。对无CPE的样品进行盲传3代培养,验证其灭活效果,并检测干热处理前后的v WF活性。结果v WF中EMCV滴度在(80±1)℃、(90±1)℃以及(99±1)℃灭活条件下,均下降超过4.0 lg TCID_(50)/0.1 m L,v WF中PPV的滴度下降也均超过4.0 lg TCID_(50)/0.1m L。干热法灭活后v WF的活性下降<20%,质量稳定。结论干热法可以灭活v WF中的PPV以及EMCV,且对样品的活性影响在允许范围之内。

响应面法优化鼠细小病毒悬液制备及滴度测定

[目的]研究鼠细小病毒(MMV)感染性滴度测定方法,同时制备高滴度的MMV。[方法]通过Box-Behnken设计-响应面法优化A9细胞制备MMV及MMV感染性滴度测定工艺。[结果]A9细胞的最佳接种浓度、病毒培养时间及病毒吸附时间分别为9×10^(3)个/孔、12 d及0 h,所建立的检测方法精密性较好;A9细胞沉淀中病毒滴度高于上清,且随病毒MOI值的升高而逐渐增加,在MOI为0.5时,感染后72 h收获,病毒滴度最高。[结论]Box-Behnken设计-响应面法适用于A9细胞制备MMV及MMV感染性滴度测定工艺。制备的病毒液的平均滴度为6.35TCID_(50)/0.1 mL。

以强阴离子交换剂FG TMAE为介质的离子交换层析制备人凝血因子Ⅷ的初探

目的初步探索以强阴离子交换剂FGTMAE为介质进行离子交换层析来制备人凝血因子Ⅷ。方法以含不同氯化钠浓度的洗脱液进行线性梯度来初步确定离子交换层析的条件，并优化离子交换层析的洗涤液和洗脱液的离子强度和pH值以及样品的温度，最终确定以强阴离子交换剂FGTMAE为介质进行离子交换层析的最适条件。结果在室温（20～25℃）条件下，以pH7．0的含220mmol／L氯化钠的洗涤液和pH7．0的含450mmol／L氯化钠的洗脱液进行离子交换层析，可使人凝血因子Ⅷ的回收率（77．53％）和比活性（24．67IU／mg）均较高。结论以强阴离子交换剂FG TMAE为介质进行离子交换层析制备人凝血因子Ⅷ是可行的。

鼠细小病毒质量对除病毒过滤验证的影响

目的探讨鼠细小病毒(murine minute virus,MVM)质量对于除病毒膜过滤验证的影响。方法利用病毒浓缩试剂盒和Sartobind Q离子交换膜在不同条件下对MVM进行两步纯化。采用滤器Virosart HF和Viresolve®Pro Micro Device,使用纯化的MVM进行2种抗体的纳米膜过滤除病毒验证。结果在2种抗体的纳米膜过滤除病毒过程中,加入两步纯化MVM的样品与未加毒的样品相比通量衰减分别仅从9%增至12%和23%,而加入仅经过病毒浓缩试剂盒纯化的MVM分别从9%增至26%和55%。结论MVM纯度的提高可改善除病毒过滤验证中的通量衰减。

以一步离子交换层析法制备人凝血因子Ⅷ/血管性血友病因子混合物的研究

目的研究一步离子交换层析法制备人凝血因子Ⅷ(factor Ⅷ,FⅧ)/血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)混合物的最适层析条件。方法以含不同浓度氯化钠的缓冲液进行线性梯度洗脱来确定层析缓冲液的最适离子强度和pH值,同时研究上样体积对该法的影响。结果使用pH7.0的含250 mmol/L氯化钠的洗涤缓冲液和含400 mmol/L氯化钠的洗脱缓冲液进行离子交换层析,所得产物的FⅧ与vWF效价比约为1∶1,FⅧ回收率为76.51%。结论采用一步离子交换层析法制备FⅧ/vWF混合物,可使FⅧ与vWF效价比达到约1∶1。

短波紫外线对人凝血因子Ⅷ中猪细小病毒灭活的研究

目的 研究短波紫外线（short-wave ultraviolet C，UV-C）对人凝血因子Ⅷ（human coagulation factor Ⅷ ，FⅧ）中猪细小病毒（porcine parvovirus ，PPV）的灭活的效果。方法 将PPV作为指示病毒与FⅧ中间品混合，用紫外灭活仪UVivatec分别以200、300 和400 J/m2 UV-C进行灭活。将UV-C灭活的FⅧ接种ST细胞并进行培养，采用细胞病变（cytopathic effect，CPE）法检测病毒，并以Reed-Muench法计算病毒滴度。对所有UV-C灭活后未出现CPE的样品盲传3 代，验证灭活效果；同时对UV-C灭活前后的FⅧ活性进行检测。结果 3个照射剂量的UV-C灭活后，FⅧ中的PPV滴度降低均0.1 ml ≥4.62 lg半数组织培养感染剂量，所有未出现CPE的样品盲传至第3代均未检到病毒。UV-C灭活的FⅧ的活性无明显降低，且各项质量指标均符合药典的要求。结论 UV-C可有效灭活无包膜病毒 PPV，且对FⅧ活性无明显影响。