药用植物活性成分的细胞工厂合成研究进展

药用植物活性成分在药物研发过程中发挥着举足轻重的作用,利用合成生物学合成这些功效成分已然成为现今的研究热点之一。合成生物学以工程学思想为指导,对天然生物代谢途径进行改造甚至重建,并设计与构建新的标准化的生物元件、组件和系统,其包含了生物化学、分子与细胞生物学、生物信息学等诸多热门学科。中药合成生物学是在合成生物学基础上,设计并构建合成药用植物功效成分的细胞工厂,用来发酵生产植物天然产物的新学科。本文综述了合成生物学的发展、药用植物活性成分细胞合成技术策略、在微生物和模式植物中合成药用活性成分的方法技术以及研究进展。讨论了合成生物学存在的困难并展望了其今后发展策略。

中草药王枣子对1~21日龄淮北麻鸡生产性能、血液生化指标及抗氧化能力的影响

试验旨在探究日粮中添加不同剂量的中草药王枣子对淮北麻鸡生产性能、血液生化指标及抗氧化能力的影响。选用1日龄淮北麻鸡500只,随机分成5组,每组5个重复。空白对照组饲喂基础日粮,试验组在基础日粮中添加0.5%、1%、2%王枣子超微粉,正对照组在基础日粮中添加50 mg/kg金霉素,试验期为21 d。结果表明:与空白对照组相比,1%和2%超微粉组麻鸡平均体重、平均日增重均增加(P<0.05),耗料增重比降低(P<0.05),其中1%超微粉组麻鸡平均体重、平均日增重、日采食量、耗料增重比与正对照组无显著差异;1%超微粉组麻鸡血清转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶活性和血清尿酸、甘油三酯、丙二醛含量均降低(P<0.05),血清蛋白含量、抗氧化酶活性及总抗氧化能力均提高(P<0.05)。可见,饲粮中添加王枣子超微粉能够提高21日龄淮北麻鸡生长性能和抗氧化能力,改善血清生化指标,添加量为1%效果最佳。

药用植物毛状根研究体系及应用方向

药用植物富含次生代谢产物,是天然药物和保健品的重要来源。然而药用植物本身的次生代谢产物存在含量低、合成不稳定且周期长等问题。利用发根农杆菌Ri质粒诱导药用植物产生的毛状根具有操作简单、生长迅速、可提高次生代谢产物含量等优点,已成为药用植物次生代谢产物生产的一种新手段。本文详细介绍了毛状根的诱导方法、鉴定以及影响其形成的因素,总结了毛状根研究体系在药用植物次生代谢产物生产、基因功能验证、种质资源改良与繁育等方面的应用,并展望了毛状根研究体系在药用植物基因功能研究与药用活性成分生产方面的发展前景。

酿酒酵母细胞中β-香树脂醇代谢流调控的研究

该研究通过使用CRISPR/CAS9基因编辑技术,成功在实验室前期保存的产β-香树脂醇酿酒酵母细胞中敲除编码胞质苹果酸合成酶(citrate synthase,CIT2)和过氧化物酶体柠檬酸合酶(malate synthase,MLS1)的CIT2和MLS1基因,并将编码磷酸葡糖异构酶(phosphoglucose isomerase,PGI1)的PGI1基因启动子替换成编码酵母线粒体蛋白细胞色素c氧化酶亚基Ⅶa(cytochrome c oxidase subunitⅦa)的核基因Cox9的启动子,从而弱化PGI1基因的表达,调节乙酰辅酶A和胞内NADPH供给,进而调控β-香树脂醇的产量。发酵实验结果表明,删除CIT2基因对β-香树脂醇的产量没有影响;删除MLS1基因后,β-香树脂醇的产量是对照菌株的1.85倍,达到了3.3 mg·L^-1。弱化PGI1基因表达后,β-香树脂醇的产量是对照菌株的3.75倍,达6.7 mg·L^-1。该研究通过使用CRISPR/CAS9基因敲除技术成功的敲除CIT2和MLS1基因并弱化PGI1基因,提高了β-香树脂醇的产量,也为后期研究β-香树脂醇的酵母异源合成提供一定的借鉴意义。

紫外光促进苦荞中黄酮类化合物积累的分子机制探究

目的研究紫外光对苦荞Fagopyrumtataricum幼苗中黄酮类化合物的影响及其分子机制。方法采用中波紫外光紫外线B(Ultraviolet Radiation B,UVB)处理苦荞幼苗,通过超高效液相色谱仪检测紫外光处理前后苦荞中芦丁等黄酮类化合物含量变化,同时采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测苦荞中黄酮类化合物合成途径中关键酶基因的表达量。结果紫外光处理后苦荞中芦丁、儿茶素和表儿茶素3种黄酮类化合物的含量均显著增加,其中芦丁含量是黑暗处理对照组的1.5倍。同时通过qRT-PCR检测发现苦荞中黄酮类化合物合成途径中苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate-4-hydroxylase,C4H)、黄烷酮-3-羟化酶(flavanone-3-hydroxylase,F3H)、二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)等11个关键酶基因的表达量均有不同程度升高。结论UVB通过正调控多个黄酮合成关键酶基因的表达促进苦荞中黄酮类化合物的积累,为阐明UVB对苦荞中黄酮类化合物的调控机制奠定基础。

产β-香树脂醇酿酒酵母细胞构建及高密度发酵

该研究通过异源表达甘草来源β-香树脂醇合成酶(β-AS),成功在实验室前期保存的酿酒酵母底盘细胞中构β-香树脂醇的合成途径,实现了利用酿酒酵母生产β-香树脂醇,发酵质量浓度达5.97 mg·L^(-1)。通过进一步过表达酵母MVA途径的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因(ERG19),甲羟戊酸激酶基因(ERG12),3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶基因(ERG13),磷酸甲羟戊酸激酶基因(ERG8)和异戊烯二磷酸酯异构酶基因(IDI1),促进酵母代谢流走向β-香树脂醇合成方向,最终成功获得Y2-C2-4工程菌株,将β-香树脂醇浓度提高一倍,达到10.3 mg·L^(-1)。通过高密度发酵策略,该菌株其β-香树脂醇的产量可达到157.4 mg·L^(-1),相对于原始菌株提高了26倍,为公开报道基因工程酵母合成β-香树脂醇的较高产量。该研究不仅为β-香树脂醇生物合成奠定了基础,也为后期研究细胞色素氧化酶及糖基转移酶的挖掘提供优势底盘菌株。

苦荞芽和苗中黄酮类化合物含量差异及关键基因表达分析

目的:研究新资源食品苦荞芽和苦荞苗中黄酮类化合物儿茶素、表儿茶素、芦丁和槲皮素的含量差异及相关基因表达情况,揭示苦荞麦种子发芽过程中黄酮类次生代谢产物及相关基因表达的动态变化趋势,为苦荞芽苗菜的品质选择提供科学依据。方法:运用超高效液相色谱-串联四级杆质谱(UPLC-ESI-QQQ-MS)对苦荞芽和苦荞苗中儿茶素、表儿茶素、芦丁和槲皮素进行含量检测,并通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)技术检测苦荞芽和苗中有关黄酮类化合物合成相关基因的表达水平。结果:通过多反应MRM模式检测发现苦荞芽和苦荞苗中儿茶素、表儿茶素、芦丁、槲皮素的相对含量及合成路径中相关基因FtPAL,FtC4H,Ft4CL,FtCHS,FtCHI,FtF3H,FtF3’H,FtFLS,FtDFR,FtLAR,FtANS,FtANR的表达量均存在差异,苦荞芽中黄酮类化合物含量和相关基因表达量均高于苦荞苗。结论:苦荞芽中黄酮类次生代谢物的更多积累可能和苦荞麦种子萌发初始阶段抵御外界环境有关。从应用角度来看,苦荞芽中的黄酮类化合物含量高于苦荞苗,具有更高的营养价值。

3种不同植物来源的tHMGR对于酿酒酵母MVA代谢流通量的比较研究

该研究对来自甘草Glycyrrhiza uralensis、黄花蒿Artemisia annua和拟南芥Arabidopsis thaliana的HMGR基因编码蛋白分别进行生物信息学分析,发现GuHMGR和AaHMGR蛋白各包含2个跨膜区,AtHMGR蛋白具有3个跨膜区。且GuHMGR、AaHMGR和AtHMGR3个蛋白均具有HMGR催化作用的活性中心结构域。将甘草、黄花蒿和拟南芥的3个截短HMGR基因(tHMGRs)连接到pYES3载体上,成功构建pYES3-tGuHMGR、pYES3-tAaHMGR、pYES3-tAtHMGR质粒。将对照pYES3质粒和重组质粒pYES3-tGuHMGR、pYES3-tAaHMGR、pYES3-tAtHMGR分别转化酿酒酵母Cen.pk2-1D,成功构建酿酒酵母菌株Y0、Y1、Y2、Y3。挑取阳性单克隆,菌株发酵后通过GC-MS检测其鲨烯、羊毛甾醇、麦角固醇的含量。采用实时荧光定量PCR检测tGuHMGR、tAaHMGR、tAtHMGR分别在菌株Y1、Y2、Y3中的相对表达情况。结果显示,过表达tAaHMGR的菌株,其鲨烯的产量以及萜类前体物质鲨烯、麦角固醇和羊毛甾醇的总产量都是最高的。实时荧光定量PCR结果发现,tAaHMGR在菌株中的相对表达量比tGuHMGR高,与菌株发酵结果一致。该研究通过比较3种不同植物来源的tHMGR对于酿酒酵母MVA途径代谢通量的影响,挑选出一个较优的tHMGR,可为今后构建酿酒酵母底盘细胞,在提高其鲨烯及萜类前体物质积累的优势基因选择上提供一些参考。