用于“野生小家鼠来源一号染色体替换系”构建的PCR-LDR分型系统

目的建立用于"野生小家鼠来源一号染色体替换系"构建的PCR-LDR(polymerase chain reactionand ligase detection reaction,PCR-LDR)分型系统。方法采用易于判断的二元性遗传标记单核苷酸多态性位点(single nuclear polymorphism point,SNP),应用连接酶检测技术(ligase detection reaction,LDR),建立PCR-LDR分型方案。结果三组多重PCR-LDR分型方案适用于覆盖整条一号染色体的29个SNP遗传位标的分型,位点间平均遗传距离在6.25厘摩(centimorgan,cM)。结论实现了后代小鼠快速、高通量的基因分型,可准确检测1号染色体各区段的重组事件。

分离培养适用于染色体分选的新生小鼠皮肤成纤维细胞

采用酶消化法分离培养新生小鼠皮肤成纤维细胞(mouse skin fibroblasts,MSFs).通过噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞术(flow cytometry,FCM),深入探讨不同培养基和血清浓度对MSFs增殖率和同步化效率的影响.结果表明:酶消化法能快速获取大量健康、高活力的MSFs;在杜氏培养液(DMEM)传代培养条件下,P2代MSFs具有高增殖率和有丝分裂指数;地美可辛工作浓度为0.05μg/mL时,阻断同步化获取M期MSFs的效率最佳.研究结果为流式细胞术分选染色体提供实验材料和研究基础.

构建基于荧光多重cPCR的小鼠基因拷贝数检测方法

目的建立基于竞争性聚合酶链式反应(competitive polymerase chain reaction,cPCR)小鼠基因拷贝数变异(copy number variations,CNVs)的检测方法,用于检测野生小家鼠来源一号染色体替换系群体(population of specific chromosome 1 substitution strains,PCSSs)的CNVs。方法选取小鼠一号染色体上11个CNVs位点,及7、9和X染色体上各1个内对照位点,分别构建克隆质粒为竞争性粒模板,应用cPCR技术,建立荧光通用引物多重cPCR检测方法。结果多重cPCR方案适用于小鼠一号染色体上11个CNV位点的拷贝数检测,且能准确检测X染色体的拷贝数。结论实现小鼠快速、高通量的CNVs检测,可准确检测小鼠1号染色体中11个CNV位点的拷贝数变异。

小鼠冷冻胚胎和精子SNP遗传鉴定方法的建立

目的建立小鼠冷冻胚胎和精子SNP(single nucleotide polymorphism)分型方法,用于冷冻胚胎和精子快速遗传鉴定方案。方法以中科院上海实验动物中心(国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心)提供的小鼠冷冻胚胎和精子为样本,采用全基因组扩增技术和PCR-LDR分型技术建立小鼠冷冻物SNP遗传鉴定方法。结果全基因组扩增技术能大幅度增加冷冻胚胎样本的DNA总量;PCR-LDR分型方法适用于小鼠全基因组45个SNPs的分型;分型确定C57BL/6,BALB/c,FVB/NJ等胚胎和精子各10种近交系,SNP位点信息与测序结果一致;小鼠冷冻胚胎个数与SNPs检出个数成正比,当胚胎数达到12以上时SNP检出率100%。结论实现近交系小鼠冷冻胚胎和精子快速SNP基因分型及遗传质量鉴定。

STR和SNP对3个小鼠1号染色体替换系筛选结果的比较

目的比较STR和SNP对3个1号染色体替换系的分型结果，并为每个替换系选择合适的基因分型方法。方法采用20个SNP和10个STR位点分别对3个1号染色体替换系N2代各40个样本进行分型。结果采用20个SNP位点，从C3H／He替换系中筛选到6个样本，从FVB／N替换系中筛选到9个样本，从AKR替换系中筛选到4个样本。采用10个STR位点，从C3H／He替换系中筛选到6个样本，从FVB／N替换系中筛选到10个样本，从AKR替换系中筛选到6个样本。结论根据每个品系基因组背景不同，可选择三组多重STR方案作为C3H／He替换系的基因分型方法，三组多重SNP方案作为FVB／N和AKR替换系的基因分型方法。

利用表达谱芯片数据筛选不同表达丰度的内参基因

目的基于表达谱芯片的检测结果,筛选多个内参基因,用于小家鼠肝脏组织中具有不同表达丰度基因的定量检测。方法应用表达谱芯片技术,完成小鼠肝脏组织的表达谱检测;依据基因表达丰度将基因分为3组,并进一步通过变异系数(coefficient of variation,CV)组内筛选候选内参基因;采用实时荧光定量PCR技术(realtime quantitative polymerase chain reaction,q PCR)和ge Norm软件确定内参基因。结果表达谱芯片成功采集超过60000个小鼠肝脏组织中转录本的表达量数据,并将之分为低、中、高3个组合。最终筛选了低表达Casp2和Lrrc14、中表达Nrd1和Trpc4ap、高表达Atp5a1和Clu,共6个内参基因。结论基于表达谱芯片数据筛选的6个内参基因,可适用于q PCR技术准确定量小家鼠肝组织转录组中不同表达丰度基因的表达量。

中国野生小鼠来源1号染色体替换系缺失突变的发掘及功能注释

目的基于野生小家鼠来源1号染色体替换系群体(population of specific chromosome 1 substitution strains,PCSSs)中18个品系的全基因组重测序结果,鉴定1号染色体上的缺失突变并对其进行功能注释。方法采用Illumina二代测序平台获取18个品系的全基因组序列信息,通过Speed Seq软件鉴定缺失突变,进一步利用Snp Eff软件完成功能注释。结果在18个品系的1号染色体上共检测到13 803个缺失突变。缺失长度从51 bp到70 kb不等,其中长度<500 bp的缺失突变约占总数的50%。多数缺失突变位于内含子区(50.361%)和基因间隔区(28.745%)。发现31个蛋白编码基因含有功能性缺失,其中有3个基因和人类疾病相关,7个基因参与了11条KEGG通路。结论 PCSSs的1号染色体上含有丰富的缺失突变,是在研究复杂性状的重要遗传标记。

染色体替换系的方案构建及评价

目的为缩短复杂性状相关基因精细定位时间，构建染色体替换系（CSSs），并对构建方案进行评价。方法以供体小鼠作为母本、受体C57BL／6小鼠作为父本进行杂交，获得N1代小鼠。将N1代雄性小鼠与C57BL／6雌性小鼠杂交，获得N2代小鼠。选择N2代1号染色体非重组的雄性小鼠与C57BL／6雌性小鼠回交，获得N3代回交小鼠；通过短串联重复序列（STR）与单核苷酸多态性（SNP）对每代一定数量的子代进行遗传分析，依次回交10代，选择N10代l号染色体未重组的样本，雌雄交配，挑选1号染色体为纯合且来自供体品系的子代小鼠，用于繁殖纯合后代。通过基因芯片扫描鉴定替换系的纯合度，并与期望值比较。结果根据构建的CSSs方案，得到2个不同的CSSs，通过基因芯片扫描得到的替换系纯合度与期望值接近。结论构建的CSSs方案可完成（部分）近交系小鼠品系目标染色体替换，供体品系背景基因组中99．59％以上已被受体C57BL／6小鼠替换，证明构建的CSSs方案可行。

miR-505慢病毒表达载体的构建

目的:构建携带增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和miR-505基因的慢病毒载体。方法:采用PCR方法从pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-505表达载体质粒扩增出miR-505 shRNA基因编码区173bp、175、171bp片段,通过限制性酶切、T4DNA连接酶连接,分别将miR-505 shRNA基因插入慢病毒表达载体FUGW与L26Fsy(1.1)GW中,构建成重组载体FUGW-miR-505-3p/5p/nc与Fsy-miR-505-3p/5p/nc。脂质体介导下将慢病毒重组载体转染至HEK 293T细胞,通过EGFP观察转染效率,RT-PCR方法检测miR-505的表达量。结果:荧光显微镜下观测到HEK 293T细胞转染后有较强绿色荧光;RT-PCR显示转染FUGW-miR-505-3p/5p与Fsy-miR-505-3p/5p的HEK 293T细胞中对应miR-505-3p/5p明显升高。结论:成功构建带有EGFP和miR-505-3p/5p/nc shRNA基因的慢病毒表达载体。

基于荧光通用引物竞争性PCR分析候选基因的表达

目的:建立用于小家鼠X染色体性发育相关候选基因筛选的一种基于荧光通用引物竞争性聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)定量技术。方法:在小家鼠X染色体上与性发育启动相关的数量性状基因座(quantitative traitlocus,QTL)区段内选择10个候选基因,应用竞争性PCR技术,建立基于荧光通用引物竞争性PCR方案。结果10个候选基因在近交系品系C57BL/6J(B6)和C3H/HeJ(C3)的下丘脑中无表达量差异。结论:本研究,通过实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-PCR)技术验证竞争性PCR方案的检测结果准确、可靠。明确10个候选基因与近交系品系B6和C3的性发育启动差异无关。

miRNA-34a基因敲除DBA1/J小鼠的建立

目的:利用CRISPR/Cas9技术,构建全基因组微小RNA-34a(microRNA-34a,miR-34a)基因敲除DBA1/J小鼠,并进行繁殖、鉴定。方法:根据CRISPR/Cas9原理,构建出miR-34a-/+DBA1/J鼠为F0代小鼠;将其与DBA1/J野生型小鼠进行杂交,通过PCR鉴定筛选出基因型为miR-34a-/+的F1小鼠;筛选miR-34a-/-的F2代小鼠,分析其生长特性、繁殖能力;通过流式细胞术检测小鼠体内免疫器官和外周血中T、B淋巴细胞比例。结果:获得2只F0代小鼠,4只F1代小鼠,5只F2代小鼠;与DBA1/J小鼠比较,miR-34a-/-DBA1/J小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群比例没有显著变化(P> 0. 05),但B淋巴细胞比例明显增加(P <0. 05);未发现miR-34a-/-DBA1/J小鼠的体重、繁殖能力有明显的改变(P> 0. 05)。结论:通过CRISPR/Cas9技术成功敲除miR-34a基因并繁殖获得目的小鼠。

改进茎环引物RT-PCR法实时定量检测microRNA

目的:为检测不同组织中microRNA(miRNA)的表达量,本研究建立了一种改进的qRT-PCR(Quantitative reverse transcription PCR)技术。方法:采用具有高特异性的茎环引物逆转录,结合SYBR Green实时定量PCR技术,建立了以延伸茎环引物RT-PCR为基础的实时定量检测microRNA的方法。结果:本研究建立的microRNA检测方法,特异性好,灵敏度高,线性范围宽。熔解曲线的单一峰型和电泳检测到的单一条带都证明了扩增的特异性。对标准品的检测跨越了7个数量级的浓度范围,最低拷贝数为103,效率高达98%。结论:利用该技术检测了120个组织样本,说明该方法可快速、准确、高效的获取不同组织中miRNA的表达量,为进一步探讨miRNA对性发育的影响提供了实验依据。

qPCR array检测高糖对胆固醇合成基因表达的影响

目的:高血糖易引起胆固醇在体内积聚,增加糖尿病合并动脉粥样硬化性心血管疾病的患病风险。本文通过建立稳定的实时定量PCR芯片(Real-time quantitative polymerasechain reaction array,qPCR array)检测方案,研究高糖对小鼠肝癌细胞Hepa1-6胆固醇合成基因表达的影响,探讨胆固醇合成基因在糖尿病大血管并发症发展中的作用机制。方法:以不同浓度葡萄糖(5、15、30mmo/L)和不同时间(0、6、12、18、24 h),刺激肝癌细胞Hepa1-6,利用qPCR array检测其胆固醇合成基因的表达差异。结果:与5mmol/L相比,高糖组(15、30 mmo/L)处理细胞18 h后,胆固醇合成基因CYP51、EBP、NSDHL、SQLE、FDFT1和PMVK的表达上调(P<0.05),呈现剂量依赖性。与0 h相比,15 mmol/L高糖处理细胞12 h,CYP51、EBP和SQLE mRNA表达量上调(P<0.01)。至24 h,CYP51、EBP降至0 h水平,而SQLE的表达量继续增加;NSDHL在12 h表达无差异,至18 h表达量发生上调(P<0.05)。结论:该qPCR array检测方案能特异性检测胆固醇合成基因的表达量。高糖能够促进胆固醇合成基因的表达,使细胞内胆固醇积聚,这可能是糖尿病患者容易发生动脉粥样硬化的原因。这提示我们将胆固醇合成基因作为药物靶点可能延缓糖尿病动脉粥样硬化进展。