单核细胞增生李斯特菌LLO-InlP缺失株的构建及部分生物学特性研究

目的构建单核细胞增生李斯特菌LLO-InlP缺失株,探究LLO、InlP基因对单核细胞增生李斯特菌生物学特性的影响。方法通过温度敏感型(Ts)质粒载体基因敲除法,构建单核细胞增生李斯特菌LM681ΔInlP、LM681ΔLLO-InlP基因缺失株,通过检测不同时间的OD 600 nm值绘制生长曲线分析LM681、LM681ΔInlP、LM681ΔInlP-ΔLLO三株菌的体外生长能力;以感染复数MOI值为10感染细胞,测定LM681、LM681ΔInlP、LM681ΔInlP-ΔLLO对人绒毛膜滋养层细胞(HTR-8/SV40)、人绒毛膜癌细胞(JEG-3)黏附侵袭能力;动物水平上测定小鼠半数致死量、感染后的脑、肝、脾载菌量。结果成功获得片段大小为1125 bp的缺失株LM681ΔInlP、LM681ΔInlP-ΔLLO(亲本株LM681为2292 bp);生长曲线结果显示,各菌OD 600值无统计学差异;3株菌体外感染HTR-8/SV40细胞、JEG-3细胞黏附侵袭试验结果显示,LM681ΔInlP、LM681ΔInlP-ΔLLO较LM681对HTR-8/SV40细胞、JEG-3细胞黏附侵袭率均极显著降低(HTR-8/SV40细胞F LM681ΔInlP-LM681=102.792、F_(LM681ΔInlP-ΔLLO-LM681)=128.459,均P<0.01,JEG-3细胞F LM681ΔInlP-LM681=203.755、F_(LM681ΔInlP-ΔLLO-LM681)=81.279,均P<0.01);LM681亲本株的LD_(50)为10^(6.78),LM681ΔInlP缺失株的LD_(50)为107.45,在攻毒剂量范围LM681ΔInlP-ΔLLO不存在LD_(50),LM681ΔInlP-ΔLLO较LM681的LD_(50)提高了6.78个对数数量级,LM681ΔInlP-ΔLLO组织载菌量整体较亲本株LM681降低。结论LLO、InlP基因缺失在动物感染水平和体外培养细胞感染水平上均极大程度的降低了LM的的毒力,且InlP基因对LM681菌株黏附侵袭滋养层细胞具有一定意义,为研究InlP在单核细胞增生李斯特菌致病中的作用奠定基础。

单增李斯特菌Lm4b_02325基因缺失株的构建及其生物学特性研究

为研究单增李斯特菌(LM)抗转录抑制因子编码基因Lm4b_02325对LM的生物学特性的影响,本研究采用同源重组技术构建Lm4b_02325基因缺失株LM928ΔLm4b_02325和回补株CLM928ΔLm4b_02325并均经PCR和测序鉴定。同时采用PCR鉴定该菌的遗传稳定性。上述结果表明基因缺失株与回补株均正确构建,且缺失株的遗传稳定性较强。根据培养不同时间的OD600nm值绘制缺失株、回补株和亲本株的生长曲线;对小鼠腹腔注射不同浓度(10^(9) cfu/mL~10^(5) cfu/mL)的3株菌,观察感染后小鼠的临床症状,统计死亡率并计算3株菌对小鼠的半数致死量(LD50)。以MOI 10将上述3种菌分别感染人脑微血管内皮细胞(HBMEC),1 h后裂解各菌,10倍倍比稀释,并涂布于BHI固体培养基,37℃培养1 d后经菌落计数,分析各株菌对HBMEC的粘附力;按照上述方法感染各菌后1 h加入庆大霉素以及感染各菌后不同时间加入庆大霉素杀死未粘附的细菌,裂解各细菌,10倍倍比稀释并涂布于BHI固体培养基,通过菌落计数结果分析各菌株对HBMEC的侵袭力及在该细胞内的增殖能力。生长曲线结果显示3株菌的生长趋势基本相似。小鼠的致病性实验结果显示,接种10^(9) cfu/mL~10^(7) cfu/mL 3株菌的小鼠出现被毛凌乱、厌食或神经症状与昏睡等临床症状,死亡率接近100%。而接种10^(6) cfu/mL~10^(5) cfu/mL 3株菌的小鼠临床症状较轻,死亡率较低。经计算LM928ΔLm4b_02325对小鼠的LD50约10^(5).45 cfu/mL,毒力明显高于LM928株及CLM928ΔLm4b_02325株(P<0.05)。粘附、侵袭力及胞内生存能力结果显示,黏附及侵入HBMEC的LM928ΔLm4b_02325菌株数量极显著(P<0.01)或者显著高于LM928(P<0.01)与CLM928ΔLm4b_02325株(P<0.05);胞内存活试验结果显示,感染后各时间点LM928ΔLm4b_02325较其余两种菌在HBMEC内的增殖速度均显著(P<0.05)或者极显著(P<0.01)加快,且前者在HBMEC中的存活数较后两者均显著(P<0.05)或者极显著(P<0.01)升高;采用荧光定量PCR(qPCR)检测黏附侵袭相关毒力基因inlA、inlB、inlC,胞内感染相关毒力基因plcA、plcB、actA、hly、mpl,内毒素调节基因prfA共9种毒力相关基因的转录水平,结果显示,LM928ΔLm4b_02325株hly、mpl、inlC的转录水平显著降低(P<0.05),actA、plcA的转录水平极显著下调(P<0.01)。其余基因转录水平均无显著变化。本研究结果首次表明Lm4b_02325基因缺失增强了LM对小鼠的致病性、对细胞的粘附性、侵袭力及胞内增殖能力,且其毒力基因hly、actA、plcA、mpl、inlA、inlC转录水平显著下调。本研究为Lm4b_02325基因的功能及在LM致病机致中作用的研究奠定基础。

单增李斯特菌Lm 4 b_02324基因缺失株的构建及生物特性研究

【目的】研究Lm 4 b_02324基因编码的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶对单增李斯特菌生物学特性的影响,为研究单增李斯特菌的致病机制奠定基础。【方法】本研究使用重叠延伸PCR技术,并通过连续传代来构建稳定遗传野生型单增李斯特菌Lm 928株的Lm 4 b_02324基因缺失株(Lm 928Δm 4 b_02324)与Lm 4 b_02324基因回补株(C Lm 928Δm 4 b_02324)。通过检测不同培养时间的D_(600)nm值并绘制生长曲线分析Lm 928、Lm 928ΔLm 4 b_02324和C Lm 928ΔLm 4 b_023243株菌的生长特性;对小鼠腹腔注射不同浓度的3株菌,观察感染后临床症状,统计死亡率,通过寇氏法计算3株菌对小鼠的半数致死量(LD 50);将Lm 928、Lm 928ΔLm 4 b_02324和C Lm 928ΔLm 4 b_02324以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10分别感染HCMEC细胞,通过检测感染后不同时间细胞内的细菌数量分析各菌株的黏附与侵袭能力和胞内生存能力;提取野生株与缺失株DNA,使用prfA、mpl、hly等9对毒力相关因子的引物,利用实时荧光定量PCR技术测定其表达情况。【结果】分别成功获得了大小为1209 bp的基因缺失株Lm 928ΔLm 4 b_02324(野生株:2517 bp)和1301 bp的回补株C Lm 928ΔLm 4 b_02324(野生株:1301 bp,条带一致),且缺失株传至15代后未出现回复突变现象;生长曲线结果显示,野生株、缺失株和回补株的生长状况差异不显著(P>0.05);LD 50测定结果显示,与野生型相比缺失株LD 50显著降低(P<0.05);黏附与侵袭力试验结果显示,缺失株的胞内存活数显著或极显著高于野生株与回补株(P<0.05;P<0.01);感染HBMEC细胞12 h内,缺失株的胞内活菌数显著高于野生株(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,Lm 4 b_02324基因的缺失使得prfA、inlA、plcA基因表达显著降低(P<0.05);hly、actA、mpl、inlC基因表达极显著降低(P<0.01)。【结论】本研究结果表明,Lm 4 b_02324基因缺失会导致单增李斯特菌对小鼠的致死率升高并增强其在胞内增殖能力,为研究Lm 4 b_02324基因在单增李斯特菌致病中的作用奠定基础。