【目的】转基因技术的发展离不开筛选标记的完善与创新,其中的可视化筛选标记在转基因中的应用越来越广泛。近年来,经过突变获得的增强型黄绿荧光蛋白(an enhanced Yellow Green Fluorescent like Protein (eYGFP) under ultraviolet (U...【目的】转基因技术的发展离不开筛选标记的完善与创新,其中的可视化筛选标记在转基因中的应用越来越广泛。近年来,经过突变获得的增强型黄绿荧光蛋白(an enhanced Yellow Green Fluorescent like Protein (eYGFP) under ultraviolet (UV),eYGFPuv(GFPuv))在365 nm紫外光线下能够发出强烈且稳定的绿色荧光,便于观察。构建GFPuv荧光筛选的基因编辑载体,并在马铃薯遗传转化中进行应用验证,为GFPuv荧光筛选在马铃薯转化中广泛应用提供技术支持,同时为后期利用基因组编辑技术创制马铃薯雄性不育系奠定基础。【方法】利用同源重组技术将GFPuv表达框架和基因编辑元件Cas9_sgRNA依次与pCAMBIA2300载体连接,并进行农杆菌介导的烟草瞬时转化试验;通过发根农杆菌Ar qual和MSU440转化马铃薯茎段,在便携紫外灯下观察,并统计荧光根;利用改造载体构建了6个马铃薯花药发育保守基因的编辑载体,通过发根农杆菌体系转化2种马铃薯材料,验证转化效率和编辑效率;利用改造载体对马铃薯进行遗传转化。【结果】成功构建了GFPuv荧光筛选的基因编辑载体pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas,瞬时转化烟草证实GFPuv表达框架能正常表达;2种发根农杆菌的转化均筛选到绿色荧光的毛状根,加入卡那霉素(kanamycin,Kan)显著提高阳性荧光根的比例,2种菌的转化效率差异不大,但MSU440的发根形成速度更快;6个马铃薯花药发育保守基因的编辑载体在2种马铃薯材料中的转化效率和编辑效率是一致的,但不同靶位点的编辑效率差异较大;改造载体遗传转化马铃薯证实GFPuv荧光可用于马铃薯愈伤组织和再生苗的筛选。【结论】发根农杆菌遗传转化体系是基因编辑效率验证的重要途径,GFPuv荧光可用于马铃薯转化的筛选。展开更多
文摘【目的】转基因技术的发展离不开筛选标记的完善与创新,其中的可视化筛选标记在转基因中的应用越来越广泛。近年来,经过突变获得的增强型黄绿荧光蛋白(an enhanced Yellow Green Fluorescent like Protein (eYGFP) under ultraviolet (UV),eYGFPuv(GFPuv))在365 nm紫外光线下能够发出强烈且稳定的绿色荧光,便于观察。构建GFPuv荧光筛选的基因编辑载体,并在马铃薯遗传转化中进行应用验证,为GFPuv荧光筛选在马铃薯转化中广泛应用提供技术支持,同时为后期利用基因组编辑技术创制马铃薯雄性不育系奠定基础。【方法】利用同源重组技术将GFPuv表达框架和基因编辑元件Cas9_sgRNA依次与pCAMBIA2300载体连接,并进行农杆菌介导的烟草瞬时转化试验;通过发根农杆菌Ar qual和MSU440转化马铃薯茎段,在便携紫外灯下观察,并统计荧光根;利用改造载体构建了6个马铃薯花药发育保守基因的编辑载体,通过发根农杆菌体系转化2种马铃薯材料,验证转化效率和编辑效率;利用改造载体对马铃薯进行遗传转化。【结果】成功构建了GFPuv荧光筛选的基因编辑载体pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas,瞬时转化烟草证实GFPuv表达框架能正常表达;2种发根农杆菌的转化均筛选到绿色荧光的毛状根,加入卡那霉素(kanamycin,Kan)显著提高阳性荧光根的比例,2种菌的转化效率差异不大,但MSU440的发根形成速度更快;6个马铃薯花药发育保守基因的编辑载体在2种马铃薯材料中的转化效率和编辑效率是一致的,但不同靶位点的编辑效率差异较大;改造载体遗传转化马铃薯证实GFPuv荧光可用于马铃薯愈伤组织和再生苗的筛选。【结论】发根农杆菌遗传转化体系是基因编辑效率验证的重要途径,GFPuv荧光可用于马铃薯转化的筛选。
