利用斑马鱼模型评价川续断皂苷Ⅴ和Ⅵ的抗骨质疏松活性

为探讨斑马鱼模型评价中药微量成分在体抗骨质疏松活性的适用性与合理性,以25μmol/L泼尼松龙诱导的斑马鱼幼鱼骨质疏松模型考察川续断皂苷V和川续断皂苷VI抗骨质疏松活性。采用茜素红对斑马鱼幼鱼骨骼染色,并以显微检测、数码成像方法定量分析骨骼染色区域。结果 25μmol/L泼尼松龙使斑马鱼骨量显著丢失,与模型组比较,川续断皂苷V和川续断皂苷VI及依替膦酸二钠阳性药均能阻止泼尼松龙诱导的斑马鱼骨量丢失,提示斑马鱼模型成功评价了微量川续断皂苷V和川续断皂苷VI的抗骨质疏松活性,具有在体化、微板化,简单、高效的特点。

基于斑马鱼模型的续断抗骨质疏松活性部位筛选

目的:利用泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型筛选续断抗骨质疏松活性部位,探讨斑马鱼骨质疏松模型的适用性与合理性。方法:将受精后5 d的斑马鱼幼鱼暴露在25μmol/L泼尼松龙溶液、0.5%DMSO的培养基中,48 h后将25μmol/L泼尼松龙溶液更换为含25μmol/L泼尼松龙的不同浓度续断总提物及其大孔树脂不同浓度醇洗脱部位(含生药0.025、0.25、2.5、25μg/mL)溶液中,同时保留一组25μmol/L泼尼松龙组作为模型对照组。28.5℃下在24孔板中培养,每天换液至第10 d处死。采用茜素红对培养10天的各组斑马鱼幼鱼骨骼染色,并以显微检测、数码成像方法定量分析骨骼染色区域。结果:与DMSO溶媒阴性对照组比较,25μmol/L泼尼松龙模型组的斑马鱼头部骨骼染色面积和染色光密度值显著减少;与模型组比较,除续断大孔树脂水与10%乙醇洗脱部位外,续断总提物及其大孔树脂30%、50%、70%、90%乙醇洗脱部位的斑马鱼头部骨骼染色面积和染色光密度值显著增加。色谱分析表明30%、50%、70%、90%乙醇洗脱部位即含皂苷类成分又含非皂苷类成分。结论:续断皂苷类和非皂苷类成分均能阻止泼尼松龙诱导的斑马鱼骨丢失。斑马鱼骨质疏松模型成功用于高效筛选中药续断的抗骨质疏松活性部位,具简单、高效及可操作性强的优势。

补骨脂水煎液和醇提物对斑马鱼骨骼发育的影响及其毒性作用

目的研究补骨脂水煎液(WD)和醇提物(EE)促骨骼发育与安全性的差异。方法将受精后3 d(3 dpf)斑马鱼幼鱼暴露于泼尼松龙(PN)25μmol·L^(-1)和WD或EE 0.1,1,10和100 mg生药·L^(-1),以及依替膦酸二钠(ED)30 mg·L^(-1)溶液中,隔天换液至9 dpf处死。茜素红染色光学显微镜观察斑马鱼头骨骨矿化面积和骨密度,荧光定量PCR法检测9 dpf斑马鱼骨保护素(OPG)和NF-κB受体活化因子配体(RANKL)m RNA表达。另将1 dpf斑马鱼胚胎置于EE 10,20,30,35,40,50和60 mg生药·L^(-1)、WD 10,50,100,125,150,175,200和500 mg生药·L^(-1)、补骨脂素(PS)12.5,25,50,100,200和400μmol·L^(-1)及补骨脂酚(BK)1,5,10,25和50μmol·L^(-1)溶液中,光镜检测3 dpf斑马鱼胚胎形态,观察记录给药后2~9 dpf胚胎或幼鱼死亡数,SPSS软件计算4,6和9 dpf LC50;另用速率法检测6 dpf斑马幼鱼谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)活性。结果与模型组相比,EE 0.1 mg生药·L^(-1)和WD 1 mg生药·L^(-1)能显著增加斑马鱼头部骨骼染色面积和骨密度(P<0.01),提示增加骨矿化量;且WD和EE 1 mg生药·L^(-1)均上调OPG m RNA、下调RANKL m RNA表达水平(P<0.01),OPG/RANKL比值显著提高(P<0.01)。EE,WD,PS和BK可致斑马鱼心包、卵黄囊肿大,GOT活性降低(P<0.01),WD和PS的LC50值分别为EE和BK的4~7倍和4.3~20倍。结论 EE较WD促骨骼发育活性强,且毒性更大,提示脂溶性特征性成分可能是起效或致毒的关键成分。

基于斑马鱼毒/效联合评价的强骨胶囊抗骨质疏松活性与安全性研究

目的用斑马鱼毒/效联合模型评价强骨胶囊(骨碎补总黄酮)抗骨质疏松活性与初步安全性。方法将受精后3 d的斑马鱼幼鱼暴露在对照组(0.4%DMSO胚胎培养用水),泼尼松龙组,依替膦酸二钠组和强骨胶囊组溶液中培养至9 d。采用茜素红对斑马鱼幼鱼头部骨骼染色,定量分析骨骼染色区域;将受精后24 h的健康斑马鱼胚胎置于不同浓度药物组中,观察记录给药后1至9 d的死亡数和3 d的斑马鱼幼鱼形态。结果 25μmol/L泼尼松龙能够成功诱导斑马鱼骨量显著丢失。与模型组比较,25 mg/L的强骨胶囊及30 mg/L依替膦酸二钠阳性药均能显著抑制泼尼松龙诱导的斑马鱼头部骨骼染色面积和累计光密度值的下降;强骨胶囊对于9 d斑马鱼的半数致死质量浓度LC50为529.87 mg/L,400 mg/L强骨胶囊溶液处理48 h斑马鱼未见明显脏器中毒,当质量浓度大于500 mg/L强骨胶囊均导致斑马鱼心脏中毒,出现心膜出血、血细胞在心区堆积及囊肿等现象。其最低中毒浓度为有效剂量浓度的20倍。结论斑马鱼毒/效联合模型成功评价了强骨胶囊的抗骨质疏松活性及其初步安全性。

基于斑马鱼模型的26种常见骨伤科中药材的毒性筛选

目的利用斑马鱼毒性模型评价26种常见伤科中药材的安全性。方法将受精后1d（1dpf）的健康斑马鱼胚胎置于不同浓度药味水煎液中,观察记录给药后15d的死亡情况,显微检视3dpf或以后斑马鱼幼鱼的形态,同时设置0.4%DMSO溶媒对照组。用SPSS16.0计算不同药味水煎液在6dpf的鱼半数致死浓度LC50。结果 13种药味（续断、知母、乳香加没药、补骨脂、独活、牛膝、制何首乌、蛇床子、木香、土鳖虫、淫羊藿和五加皮）水煎液致斑马幼鱼脏器形态明显改变,毒性主要表现为卵黄囊肿大、变形、变黑,心包水肿、出血等,且它们的鱼LC50值较低（16.9689.7μg/mL）。其余13种药味（鹿衔草、千年健、苏木、巴戟天、龟甲、骨碎补、丹参、狗脊、桑寄生、鸡血藤、熟地黄、女贞子、杜仲）,未见鱼脏器毒性,且致鱼死亡浓度高（在2 000μg/mL以上）,较安全。结论用斑马鱼模型成功的筛选了26种常见骨伤科中药的毒性,为骨伤科中药临床合理应用提供参考。斑马鱼模型具有简单、高效、实时动态的优势,使中药在体毒性规模化筛选成为可能。

基于斑马鱼模型筛选壮骨关节丸毒性药味高效筛选

目的:采用斑马鱼模型高效筛选壮骨关节丸中有毒性的药味。方法:将受精后1天(1 day post fertilization,1dpf)的斑马鱼胚胎暴露于壮骨关节丸及方中12种药味不同浓度水煎液和醇提液中,观察记录给药后2-6 dpf或2-8 dpf的死亡数量,于3 dpf显微检视斑马鱼幼鱼状态,SPSS软件计算6 dpf的斑马鱼半数致死浓度LC50。结果:斑马鱼暴露于壮骨关节丸及补骨脂、续断、乳香没药、独活和木香的水、醇提取液,以及鸡血藤和狗脊的醇提液毒性较大,致鱼卵黄囊肿大、变形或变黑,提示与肝毒相关,6 dpf鱼的LC50为33.2-392.7μg·m L-1(已折算为生药量,下同);淫羊藿水、醇提取液均在1 500μg·m L-1致鱼卵黄囊肿大、变黑,LC50为1 100-1 350μg·m L-1,有一定毒性;鸡血藤和狗脊的水煎液,以及骨碎补、桑寄生和熟地黄的水、醇提取液未致鱼脏器明显改变,LC50大于1 500μg·m L-1,故安全性较好。结论:斑马鱼模型高效辨识了壮骨关节丸不同药味毒性差异,可实现复杂中药中潜在毒性物质的在体、实时、动态、规模化的高效筛选。

接骨汤抗泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失的作用研究

目的:本文采用泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型,研究临床优效方接骨汤防止骨丢失,促进骨生成的作用。方法:将受精后5天的斑马鱼幼鱼暴露在含25μmol·L-1泼尼松龙的不同浓度接骨汤(0.025、0.25、2.5、25、100 mg生药·L-1)溶液中,同时设25μmol·L-1泼尼松龙模型药物组,含25μmol·L-1泼尼松龙的依替膦酸二钠(15、30 mg·L-1)阳性药物组及0.5%DMSO溶媒对照组。28.5°C下在24孔板中培养,每天换液培养至第10天处死。采用茜素红对培养10天的各组斑马鱼幼鱼骨骼染色,并以显微检测、数码成像方法定量分析骨骼染色区域。结果:与溶媒阴性对照组相比,25μmol·L-1浓度泼尼松龙组(模型组)的斑马鱼骨骼染色面积和染色光密度值显著减少;与模型组比,依替膦酸二钠(15、30 mg·L-1)和接骨汤(2.5、25、100 mg生药·L-1)组的鱼骨染色矿化面积和累积光密度值显著增加,且呈一定量效关系。结论:用泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型成功评价了接骨汤防止骨丢失,促进骨生成的作用,为该模型的合理性与可靠性提供依据。

基于斑马鱼模型的朝鲜淫羊藿抗骨质疏松活性部位筛选

目的利用泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型筛选朝鲜淫羊藿抗骨质疏松活性部位,探讨斑马鱼骨质疏松模型的适用性与合理性。方法将受精后4 d的斑马鱼幼鱼暴露在25μmol/L泼尼松龙模型药物组,含25μmol/L泼尼松龙的15μg/mL依替膦酸二钠阳性药物组,0.5%DMSO溶媒对照组、含25μmol/L泼尼松龙的朝鲜淫羊藿总提物(生药0.1、1.0、10.0、100.0μg/mL)及其大孔树脂水及30%、50%、70%、90%乙醇洗脱部位(生药1.0、10.0、100.0、1 000.0μg/mL)溶液组,28.5℃下在24孔板中培养,每天换液至第9天处死。采用茜素红对各组斑马鱼幼鱼骨骼染色,并以显微检测、数码成像方法定量分析骨骼染色区域。结果与对照组相比,模型组斑马鱼头部骨骼染色面积和染色光密度值显著减少;与模型组比较,除朝鲜淫羊藿大孔树脂水洗脱部位外,朝鲜淫羊藿总提物及30%、50%、70%、90%乙醇洗脱部位的斑马鱼头部骨骼染色面积和染色光密度值显著增加。色谱分析表明30%、50%、70%、90%乙醇分离部位主要含黄酮类成分和少量非黄酮类化合物。结论斑马鱼骨质疏松模型成功用于高效筛选朝鲜淫羊藿的抗骨质疏松活性部位,具简单、高效及可操作性强的优势。

二维斑马鱼模型联合色谱技术高效筛选中药抗骨质疏松活性成分的思路与方法

目的:提出以二维斑马鱼模型联合色谱技术突破评价模型和化合物数量制约,建立高效筛选中药抗骨质疏松活性成分新方法。方法:根据本课题组相关研究及国外有关文献资料,依据斑马鱼骨质疏松模型可高效评价活性,斑马鱼代谢模型可高效富集代谢产物,现代色谱联用技术可高效分离、分析中药成分,提出三者有机联合有望高效解码中药抗骨质疏松体内、外药效物质。结果与结论:该方法使中药成分特别是量微成分与代谢产物的富集、分离分析、在体抗骨质疏松活性筛选简单、高效,充分体现中药药效物质含原形成分及代谢产物,具"多成分,多靶点,整体作用"的特点,为中药抗骨质疏松活性成分的早期、快速发现提供新思路与方法。

色谱捕获联合斑马鱼模型高效筛选补骨脂抗骨质疏松活性成分

目的采用色谱捕获联合斑马鱼模型高效筛选补骨脂抗骨质疏松活性成分。方法用高效液相色谱分析捕获补骨脂香豆素类、黄酮类及补骨脂酚等成分/组分,用25μmol·L-1泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型评价捕获的成分/组分、补骨脂素和异补骨脂素的活性,同时设25μmol·L-1泼尼松龙模型药物组,0.4%二甲基亚砜(DMSO)培养基对照组。采用茜素红对培养至8 dpf的各组斑马鱼幼鱼骨骼染色,进行显微检测、数码成像,并用图像软件定量分析骨骼染色区域。结果补骨脂香豆素类和黄酮类均具显著的抗泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失作用,但补骨脂酚作用较弱,且毒性较大,高剂量可致斑马鱼全部死亡。结论高效液相色谱可系统分析、任意捕获补骨脂成分/组分,斑马鱼骨质疏松模型可在体评价捕获的量微成分/组分,二者有机结合同时突破了中药复杂成分获取与在体高效评价的双重瓶颈,有望实现中药全成分抗骨质疏松成分/组分的高效筛选。

基于斑马鱼毒/效同步评价的壮骨关节丸促骨骼发育作用与初步安全性研究

目的用斑马鱼毒/效同步法评价壮骨关节丸的促骨骼发育作用及初步安全性。方法将受精后3d(3daypost fertilization,3 dpf)的斑马鱼幼鱼暴露于25μmol·L-1泼尼松龙(prednisolone,PN),壮骨关节丸溶液及含PN的壮骨关节丸溶液(12.5,25,50,100,200,300和400μg·mL^(-1))中,0.5%DMSO胚胎培养基为空白对照,于28℃培养至8 dpf,隔天换一半药液。采用茜素红对8 dpf的斑马鱼幼鱼头部骨骼染色,定量分析骨骼染色区域;给药期间每天同步观察鱼死亡及脏器中毒情况。结果在8dpf时,100μg·mL^(-1)及以上浓度的壮骨关节丸健康鱼组和含PN的壮骨关节丸模型鱼组斑马鱼死亡率>80%,未进行骨骼染色。壮骨关节丸健康鱼组(12.5,25,50μg·mL^(-1))的斑马鱼头骨矿化面积和累积光密度值IOD与PN组比较显著增加(P<0.01或<0.05),而含PN的壮骨关节丸模型鱼组(12.5,25,50μg·mL^(-1))斑马鱼的头骨矿化面积或IOD结果显示阻止PN致骨丢失的趋势,但均低于健康鱼组。给予壮骨关节丸后,PN模型鱼的死亡速度和死亡率较健康鱼高,鱼死亡率与给药浓度和时间呈依赖性;PN模型鱼的6dpf和8dpf半数致死浓度值(63.92,63.92μg·mL^(-1))均低于健康鱼(94.66,87.84μg·mL^(-1))。结论斑马鱼毒/效同步法快速评价了壮骨关节丸对健康鱼和模型鱼的骨骼发育作用及初步安全性。壮骨关节丸对健康鱼和模型鱼的作用及毒性有差别。