P53与乙型肝炎病毒增强子Ⅰ上游P53样应答元件结合序列关系研究

背景与目的:在前期工作中,我们经计算机序列分析发现,在乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)基因组增强子Ⅰ上游1047～1059bp存在P53样应答元件结合序列5'-TGCC(G)TTGCCT-3',体外实验应用凝胶迁移方法(EMSA和EMSSA)发现这段序列与P53蛋白能够进行特异性结合。本实验拟观察肝癌细胞中P53蛋白与HBV基因组P53样应答元件结合序列之间的关系。方法:报告基因质粒pX-CAT上游为X基因增强子和启动子序列,其中含有P53样应答元件结合序列5'-TGCGTTGCCT-3'。首先用PCR方法将pX-CAT质粒中5'-TGCGTTGCCT-3'进行点突变,成为5'-TGTATTGTAT-3',以破坏P53样应答元件结合序列。将pX-CAT和变异后的pX-CAT(mpX-CAT)分别单独或与pCMV-p53质粒共转染HepG2细胞,通过检测报告基因CAT的活化情况,观察P53蛋白与这段DNA序列的作用关系。将HBV基因P53样应答元件结合序列反向构建于真核表达质粒pZeoSV2中(αpZeoXP),转染HepG2.2.15细胞并稳定筛选,以封闭HBV基因上P53样结合位点,观察细胞中P53/P21蛋白表达的改变,以及细胞周期、细胞凋亡的变化。结果:HepG2细胞中,报告基因CAT活性在pCMV-p53与pX-CAT共转染组较pX-CAT单独转染组明显升高(1.353vs0.738,P<0.05),而mpX-CAT单独转染组CAT活性则明显降低(0.304),即使与pCMV-p53共转染CAT活性?

乙型肝炎治疗的新靶点与新方法

抗病毒治疗一直是乙型病毒性肝炎治疗过程中的重要环节,但目前所用的抗病毒治疗措施均有其局限性.寻找新的、有效的抗病毒治疗措施应从病毒的生命周期、机体的免疫反应出发,以达到抑制病毒复制以至清除病毒的目的. 基因治疗方法也正处于研究阶段.本文就目前乙型病毒性肝炎的抗病毒治疗及其进展方面作一阐述.

肝素对刀豆蛋白A诱导昆明小鼠急性肝损伤的保护作用

为了观察肝素预处理对刀豆蛋白A(ConA)诱导昆明小鼠急性肝损伤的保护作用 ,将 2 4只昆明小鼠随机均分为A、B、C 3组。A组为正常对照组 ;B组经小鼠尾静脉一次性注射给予一定剂量的ConA ,造成急性重型肝损伤 ;C组在给予ConA同时皮下注射肝素 10 0U。结果发现 ,与单纯ConA处理组相比 ,肝素预处理组小鼠 8h死亡率明显降低 ,血清ALT水平下降 (P <0 .0 5 ) ,肝窦瘀血及肝脏炎症程度明显减轻 ,肝组织匀浆中MDA水平显著降低。因此认为 。

2012年EASL-EORTC《肝细胞癌临床管理指南》简介

欧洲肝脏研究学会和欧洲癌症研究治疗组织于2011年底首次联合颁布了《肝细胞癌临床管理指南》,对肝细胞癌的监测、诊断、分期系统、分子分类和治疗策略提出建议,旨在根据循证医学证据为医生、患者、保健人员和政策制定者提供实践指导。

不同p53状态的肝癌细胞系DNA损伤修复能力的比较

目的 观察不同 p5 3状态的肝癌细胞在DNA损伤因素存在下 ,探讨 p5 3在肝细胞癌发生过程中的作用。 方法 选用内源性表达野生型 p5 3、突变型 p5 3、p5 3全基因缺失的HepG2、PLC /PRF / 5、Hep3B肝癌细胞系 ,将含有 p5 3结合序列的CAT报告基因质粒分别转染各细胞 ,通过ELISA方法检测报告基因CAT活化情况 ,观察 p5 3功能状态 ;用细胞生长曲线比较不同p5 3状态的细胞生长速度的差异 ;给予一定剂量的紫外线照射 ,检测各细胞程序外DNA损伤修复 (UDS)能力 ;观察紫外线照射后细胞克隆形成情况 ,反映不同细胞系在紫外线照射后细胞存活率的不同。结果 报告基因CAT在HepG2细胞表达最强 ,而在PLC /PRF / 5、Hep3B肝癌细胞均处于较低水平 ,说明HepG2细胞具有功能性的p5 3表达 ;HepG2细胞生长速度明显慢于其他两种细胞 ;紫外线照射后 ,HepG2具有较好的DNA损伤修复能力以及较高的细胞生存率。 结论 野生型 p5 3具有抑制肝癌细胞生长、保持细胞良好的DNA损伤修复的功能。

抑制性消减杂交技术筛选干扰素α转染HepG2细胞中上调的表达基因

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术筛选干扰素α(IFN-α) 真核表达质粒转染HepG2细胞后差异表达上调的基因。方法:首先构建IFN-α真核表达载体pcDNA3．1(-) -IFN-α,并转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增鉴定,进行测序及同源性分析。结果:构建了pcDNA3．1(-)-IFN-α真核表达质粒,并成功构建了该质粒转染HepG2细胞后差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到200个白色克隆,随机挑取70个进行菌落PCR分析,结果显示均含有插入片段,将含有200-1000 bp插入片段的35个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得17种已知基因序列和1个染色体序列。结论:应用SSH技术成功构建了pcDNA3．1(-)-IFN-α转染的HepG2细胞中差异上调表达基因的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明IFN-α作用的分子生物学机制提供了重要的理论依据。

肝细胞癌免疫治疗的现状与挑战

免疫疗法是目前肿瘤治疗的一种新方法,应用前景广阔,在治疗相关毒性和疗效方面较传统疗法均具有明显优势。免疫检查点抑制、克服肿瘤免疫逃逸和重建抗肿瘤免疫机制是肿瘤免疫治疗的关键。在肝细胞癌中,免疫治疗尚处于初级阶段,免疫治疗单独或联合其他治疗方法可能有利于控制肿瘤进展,但总体疗效仍然有限。本文结合免疫治疗在肿瘤中的研究和应用进展,分析了肝细胞癌免疫治疗研究现状以及面临的挑战。

拉咪呋啶治疗乙型病毒性肝炎的研究近况

拉咪呋啶是新近用于乙型病毒性肝炎治疗的新一代核昔类似物,并显示了强大的抗乙型肝炎病毒(HBV)活性,预计不久可全面用于临床。本文综述了拉咪呋啶在乙型病毒性肝炎治疗中的研究近况。

不同肝癌细胞系中P53/P21/MDM2表达初步观察

选用P53状态不同的Hep3B、PLC/PRF/5、HCC-9204、HepG2、HepG2215细胞,通过Western印迹分析观察各细胞P53蛋白以及P53下游基因p21、mdm2蛋白表达情况;将报告基因PG13-CAT转染细胞,通过观察CAT酶表达水平反映各细胞中P53的反式活化功能;P21-LUC质粒细胞内转染,比较不同细胞中P53对P21启动子的活化情况。结果显示,PLC/PRF/5细胞中P53蛋白高表达、低功能,但P21蛋白以及报告基因P21-LUC转染细胞后荧光素酶均具有较高水平表达;Hep3B细胞中P53蛋白无表达、无功能,P21蛋白低表达,MDM2蛋白表达相对较高;HCC-9204细胞具有较高MDM2表达,P53蛋白表达及功能均较低,P21亦呈低表达;HepG2215较HepG2细胞具有较高的P53、P21蛋白表达,P53活化报告基因的活性也较强。结果提示,肝癌细胞中P53活性与其表达水平、存在状态有关;某些细胞中P21的活化表达存在不依赖于P53的途径;MDM2与P53的表达具有负性相关倾向。

p53与HBV相互作用对7721细胞凋亡及p21启动子的影响

为了观察HBV与p5 3是否存在相互作用关系 ,以进一步揭示与原发性肝细胞肝癌发生发展的相关机制 ,选用 772 1肝癌细胞系 (表达野生型p5 3,HBV阴性)为靶细胞 ,应用磷酸钙转染法 ,将pCMVp5 3单独或者与野生型HBV质粒 (pCMVHBVa)、突变型HBV质粒(pCMVHBVb)共转染细胞 ,用annexin Ⅴ FITC标记及流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。各组另与含有p2 1基因启动子的荧光素酶报告基因质粒p2 1 luc共转染细胞 ,通过检测荧光素酶的表达 ,了解p2 1启动子的活化情况。结果表明 ,单独的pCMVp5 3质粒转染 772 1细胞系能够促进p2 1报告基因的表达 ,细胞凋亡率升高 ;pCMVp5 3与pCMVHBVa共同转染时 ,对p2 1基因启动子的激活作用增强、细胞凋亡率明显增加 ,而与pCMVHBVb共转染时则否。提示HBV在该细胞内的复制能够诱导增强p5 3的作用并对其下游基因p2 1的转录有促进作用 。

乙肝病毒HBX抗原与p53相互作用及其对肝细胞癌发生的影响

HBX抗原是乙肝病毒最小编码框X基因区编码的蛋白 ,研究证明它与HBV相关性肝癌的发生有关 ;抑癌基因p5 3的变异或失活也与肝细胞癌 (HCC)的发生密切相关。研究HBX抗原与 p5 3的相互作用关系 ,有助于进一步揭示HBV相关性肝癌的发病机制。

乙型肝炎相关性肝细胞癌HBV复制及其癌组织中HBsAg/HBcAg表达的研究

目的以慢性乙型肝炎(chronic hepatitisB,CHB)患者为对照,观察乙型肝炎相关性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者血清中HBVDNA水平的变化,以及HCC组织中HBsAg/HBcAg的表达情况,探讨HBV导致HCC的可能机制。方法 HCC组89例,CHB组120例。采用实时定量PCR法检测血清HBVDNA水平;分别留取肝脏穿刺组织标本(HCC组织均带有癌旁肝硬化组织),用免疫组化法检测组织中HBsAg/HBcAg的表达情况。结果 HCC组血清HBVDNA水平明显低于CHB组(P<0.05);在CHB组织、癌旁肝硬化组织和HCC组织中HBsAg表达阳性率分别为90%、51%和10%,HBcAg阳性率分别为78%、19%和3%,与CHB组织、癌旁肝硬化组织相比,HCC组织中2种抗原表达均明显较低(P均<0.05)。结论在HBV慢性感染不同疾病阶段,血清HBVDNA水平和HBsAg/HBcAg在肝组织内的表达具有显著差异;与CHB组相比,HCC组HBVDNA水平较低,HBsAg/HBcAg表达显著缺失,这可能与HCC患者HBVDNA复制水平降低有关,但也不排除其他因素导致HBsAg/HBcAg表达抑制。

HBV增强子及其调节因子

HBV的增强子序列不但对于HBV的复制、而且对肝癌的发生可能起重要作用 ,有多种因子参与其活性的调节。

乙型肝炎病毒X基因经p53依赖性与非依赖性途径对p21^(WAF1)表达的影响

背景与目的研究表明,在不同情况下乙型肝炎病毒X基因(HBx)对p21WAF1的表达具有不同的影响,但作用机制仍不清楚。本研究的目的是探讨HBx对p53下游基因p21WAF1的影响。方法通过正、反义野生型p53(wtp53)与HBx单转染及共转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,以及HBx转染不同内源性p53状态的肝癌细胞株,检测p21WAF1启动子荧光素酶基因表达,并用流式细胞仪观察细胞周期的变化,Westernblot法比较p53、p21WAF1表达水平的变化。结果正、反义wtp53与HBx单转染及共转染SMMC-7721细胞,HBx与正义wtp53共转染组(1.007±0.098)与单转染正义wtp53(0.490±0.012)相比,p21WAF1启动子荧光素酶基因表达明显升高(P<0.05),其余各组HBx均可导致p21WAF1启动子荧光素酶基因表达明显减少(P<0.05)。Westernblot法表明HBx可导致p53的表达增加,但p53表达较低的SMMC-7721细胞转染HBx后p21WAF1蛋白的表达减弱,p21WAF1启动子荧光素酶基因表达(0.053±0.010)也较对照组(0.094±0.013)明显减少(P<0.05),而p53表达较强的HepG2细胞转染HBx后p21WAF1蛋白的表达增强、p21WAF1启动子荧光素酶基因的表达(1.252±0.052)较对照组明显升高(0.767±0.031)(P<0.05)。细胞周期结果表明瞬时转染HBx的SMMC-7721和Hep3B细胞停滞在G0-G1期细胞数(42.31%、36.96%

氩氦刀冷冻消融治疗乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌前后PD-1的变化及其与预后的关系

目的观察氩氦冷冻消融治疗对乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌(HCC)患者外周血细胞程序性死亡受体-1(PD-1)表达的影响,分析PD-1与HCC病程及患者预后的关系。方法收集2006年1月-2009年1月收治的乙型肝炎病毒相关性HCC患者141例,其中男109例,女32例,年龄28～71岁,巴塞罗那分期(BCLC)早期46例,中期63例,进展期32例。采用流式细胞仪检测患者外周血细胞PD-1表达的百分比,分析PD-1与HCC进展的关系。对109例早、中期HCC患者进行氩氦冷冻消融治疗,比较治疗前后患者外周血PD-1表达的变化。将早期及中期患者根据术前PD-1表达的中位值(10.88%)分为4组,即早期低表达组(4.05%±1.28%,n=23)、中期低表达组(9.26%±1.63%,n=31)、早期高表达组(9.26%±3.09%,n=23)和中期高表达组(18.05%±3.78%,n=32),采用Kaplan-Meier法计算各组的无肿瘤生存时间(TFS)和总生存时间(OS)并进行比较。结果 PD-1表达水平在BCLC早期患者中为6.66%±3.52%,中期患者中为13.72%±5.29%,进展期患者中为20.28%±11.89%。氩氦刀冷冻消融治疗后4周,109例HCC患者PD-1表达水平均较术前降低,其中11例术后复发患者复发后的PD-1表达较术后明显升高。PD-1高表达组(包括早期和中期)的TFS及OS均较低表达组(包括早期和中期)明显缩短。结论 HCC患者外周血细胞PD-1分子的表达随肿瘤进展而逐渐增加,氩氦刀冷冻消融治疗可降低HCC患者PD-1的表达;术前PD-1水平可用于预测HCC患者氩氦刀术后的生存期。

肝脏微血管密度在索拉非尼联合冷冻消融治疗进展期肝癌疗效评价中的意义

目的探讨索拉非尼联合局部冷冻消融治疗进展期肝细胞癌(HCC)的疗效,评价肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD)与HCC患者治疗预后的关系。方法 102例进展期肝癌患者随机分为索拉非尼联合冷冻消融治疗组(S&C组,50例)和冷冻消融治疗组(C组,52例),分别给予索拉非尼联合冷冻消融治疗及单独冷冻消融治疗,治疗终点为肿瘤进展或出现不能耐受的毒性;治疗前留取肝癌组织标本,并通过计数CD34免疫组化数值来评估肝癌组织微血管密度(MVD),每4～6周按照RECIST标准进行疗效评价,随访生存期及肿瘤进展情况,分析肝癌组织MVD值与预后的关系。结果 S&C组2例完全缓解(CR),9例部分缓解(PR),22例疾病稳定(SD),疾病控制率(disease control rate,DCR)66%;C组4例PR,19例SD,DCR44.2%(P=0.027);S&C组患者中位生存期(OS)和中位肿瘤进展时间(TTP)分别为12.5和9.6个月,而C组患者仅为8.6和5.3个月(P=0.019)。CR&PR组的肝组织平均微血管密度(111/0.74mm2)明显低于疾病进展组(339/0.74mm2,P=0.0001)。具有较低肝组织微血管密度的患者在接受索拉非尼联合氩氦刀冷冻消融联合治疗后其中位总生存期和中位肿瘤进展时间明显长于单纯氩氦刀冷冻消融组;具有较高肝组织微血管密度的患者其中位总生存期和中位肿瘤进展时间在两组治疗方式中无区别。结论索拉非尼联合局部冷冻消融治疗能显著延长进展期HCC患者的生存期及肿瘤进展时间,使进展期HCC患者临床获益;进展期肝癌患者肝组织中较高的微血管密度预示较差的治疗应答。

索拉非尼治疗进展期肝细胞癌的疗效及预后因素分析

目的:评价索拉非尼治疗进展期肝细胞癌(HCC)的疗效及分析其预后影响因素方法:前瞻性分析2007年8月至2009年7月间110例接受索拉非治疗的进展期HCC患者,评价其疗效、不良反应,以总生存期和无肿瘤进展生存期为预后指标进行单因素和Cox比例风险模型多因素分析。结果:110例患者随访中位时间9(2～18)个月,服用索拉非尼中位时间6.5(2～18)个月14例(12.7%)获得完全缓解(CR),16例(14.5%)部分缓解(PR),40例(36.4%)病情稳定(SD),总有效率为70例(63.6%)。中位生存期和无肿瘤进展生存期分别为10.5个月(95%CI:8.7～12-3)和5.0个月(95%CI:3.7～63)。多因素分析显示:联合局部治疗(肝动脉化疗栓塞或氩氦刀)、美国东部肿瘤协作组活动状态评分(Eastern Cooperative OncologyGroup performanee slatus score,ECOG PS)和Child-Pugh分级是影响无肿瘤进展生存时间的独立预后因素,而联合局部治疗、ECOG PS评分和AFP(alfa-fetopro-lein)水平是影响总生存期的独立预后因素。亚组分析显示:在肝癌进展组患者中继续服用索拉非尼其总生存期明显长于终止索拉非尼治疗者(11个月vs.7.5个月,P<0.001)。结论:索拉非尼治疗进展期HCC,ECOG PS评分是影响生存期的一个重要因素。

索拉非尼联合冷冻消融治疗乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌的研究

目的探讨索拉非尼联合局部冷冻消融治疗进展期乙型肝炎病毒(HBV)相关性肝细胞癌(HCC)的疗效及安全性。方法收集2007年7月-2009年9月收治的102例进展期肝细胞癌患者,均为HBV感染,随机分为2组,S+C组(n=50)给予索拉非尼联合冷冻消融治疗,C组(n=52)仅给予冷冻消融治疗。每4～6周按照实体瘤疗效评价标准(RECIST)进行疗效评价,治疗终点为肿瘤进展或出现不可耐受的毒性。按美国癌症研究所的常规毒性判定标准(NCI-CTC)评价治疗后的不良反应,随访生存期及肿瘤进展情况。结果 S+C组2例完全缓解(CR),9例部分缓解(PR),22例疾病稳定(SD),疾病控制率(DCR)为66.0%。C组0例CR,4例PR,19例SD,DCR为44.2%。S+C组患者中位生存期(OS)和中位肿瘤进展时间(TTP)分别为11.0和6.0个月,而C组分别为7.5和3.5个月,两组间差异有统计学意义(P<0.01)。S+C组患者出现皮疹、高血压、手足综合征、腹泻、肝功能异常、白细胞减少、上消化道出血等不良反应的比例分别为62%、54%、42%、42%、34%、20%和12%,其中发生3级以上严重并发症的患者分别为4%、2%、22%、6%、6%、4%、6%。结论索拉非尼联合局部冷冻消融治疗进展期HCC安全、有效,能显著延长进展期HCC患者的生存期及肿瘤进展时间。

胃癌组织癌基因ERBB3过表达的免疫组化研究

目的研究癌基因ERBB3编码的ERBB3蛋白在胃癌组织和正常组织的表达情况,探讨ERBB3基因在胃癌发生发展中的作用。方法65例不同病理类型的胃癌组织(Lauren病理分类,其中肠型胃癌43例,弥散型胃癌22例)及65例正常对照组织进行免疫组织化学染色,并按照胃癌的不同病理类型、TNM分期将检测结果进行对比观察。结果胃癌组(65例)ERBB3蛋白过表达者7例,占10.8%,而正常对照组(65例)只有1例过表达,占1.6%,两组相比差异有显著性(P<0.01),且ERBB3蛋白在弥散型胃癌的过表达率高于肠型胃癌(27.3%vs2.3%,P<0.01)。ERBB3蛋白过表达与胃癌TNM分期相关联,Ⅳ期患者中ERBB3过表达的阳性率显著高于其他期的患者。结论ERBB3蛋白在胃癌中存在过表达,提示患者预后不良,其机制可能与其参与了胃癌的低分化病理过程有关。