江苏地区火鸡组织滴虫β-微管蛋白基因的克隆及系统发育分析

从分子水平了解江苏地区火鸡组织滴虫的分类地位与进化特征,以江苏地区感染火鸡组织滴虫发病鸡群的病变肝脏组织为材料,通过DNA提取、PCR扩增、DNA片段的克隆与测序,获得该地区火鸡组织滴虫β-微管蛋白（Betatubulin）序列,通过软件与GenBank收录的其他地区火鸡组织滴虫和相关虫体β-微管蛋白基因序列进行系统发育分析。结果获得的11个火鸡组织滴虫β-微管蛋白基因序列相互之间同源性在95.3%-100.0%之间,亲缘关系较近,与德国株相似性94.9%以上,与美国株相似性91.6%以上。同时,该地区虫体在基因进化过程中形成2个大的分枝和多个小的分枝。表明江苏地区火鸡组织滴虫存在不同的基因型,应进一步研究其分子流行病学与种群遗传学特征。

黄羽肉鸡实验性感染火鸡组织滴虫后体内虫体的动态分布

为研究火鸡组织滴虫感染黄羽肉鸡后在其体内的动态分布,本研究将JSYZ-A株虫体通过泄殖腔感染15日龄苏禽黄羽肉鸡,在感染后1d^34d内,每3d迫杀5只感染鸡,采集其不同组织脏器样品,并对样品进行PCR检测。结果显示,火鸡组织滴虫主要靶器官为肝脏和盲肠。感染后4d,感染鸡肝脏和盲肠中检测到虫体特异性基因,感染后13d和16d虫体检出率即达到100%,之后检出率逐渐降低,一直持续到感染后34d还能检测到虫体特异性基因。感染后10d^22d从鸡十二指肠、直肠和脾脏能够检测到虫体特异性基因。感染后13d^19d从鸡腺胃和空肠、心脏均检测到虫体特异性基因。感染后19d从鸡肺脏检测到虫体特异性基因,并且呈现一过性感染。感染鸡的胰腺、脑、肾脏和睾丸组织在整个实验过程中并未检测到虫体DNA。上述结果为临床火鸡组织滴虫致病机理的研究、诊断奠定了基础。

黄羽肉鸡感染火鸡组织滴虫后血清生化指标的动态变化

为了进一步从病理生理角度探究火鸡组织滴虫的致病机理,通过火鸡组织滴虫JSYZ-A株泄殖腔感染15日龄苏禽黄羽肉鸡,感染后7~31 d,每3天采集非抗凝血进行常规生化指标的测定。结果显示:火鸡组织滴虫的感染会导致感染鸡增重缓慢,谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷氨酰胺转移酶、球蛋白含量不同程度上升,尿素氮、葡萄糖含量下降,甘油三酯浓度先升后降,而其他生化指标无明显异常。肝脏是火鸡组织滴虫入侵的主要靶器官,其功能受到广泛损伤,是导致鸡群发病、增重下降和死亡的主要原因。研究结果为火鸡组织滴虫致病机理的阐明和组织滴虫病的药物防治提供了一定的参考依据。

江苏地区火鸡组织滴虫18S rRNA基因的克隆及系统发育分析

为从分子水平了解江苏地区火鸡组织滴虫的分类地位和特征,本研究以江苏地区感染火鸡组织滴虫的发病鸡群的病变肝组织为材料,通过DNA提取、PCR扩增、DNA片段的克隆及测序,获得了江苏地区火鸡组织滴虫11个18S rRNA序列,并与GenBank上登录的其他地方火鸡组织滴虫和相关虫体18S rRNA基因序列进行了系统发育分析.结果表明,江苏地区火鸡组织滴虫18S rRNA基因同源性在99.0％～99.8％之间,亲缘关系较近,但形成2个分支,可能存在不同的基因型.研究结果为火鸡组织滴虫的分子诊断、分子流行病学调查以及种群遗传学的进一步研究奠定了基础.

鸡组织滴虫病PCR病原学诊断方法的建立

为建立鸡组织滴虫(H.meleagridis)的PCR检测方法,本研究以确诊的感染火鸡组织滴虫的阳性鸡的肝组织DNA为模板,设计针对18S rRNA基因高度保守的特异性引物,建立组织滴虫病的PCR诊断方法。敏感性试验显示阳性样品组织DNA的最低检出限为4 ng/μL。特异性试验表明与其他常见鸡寄生虫的DNA样品均无交叉反应。该PCR方法对临床样品的检出率为100%,与组织病理学诊断结果符合率为100%。该诊断方法敏感、特异,可以用于组织滴虫病的临床诊断。

鸡源火鸡组织滴虫JSYZ-A株的分离与鉴定

对组织滴虫病临床发病鸡的肝和盲肠进行了虫体的分离及体外培养,通过形态学和基于18S rRNA的分子生物学方法进行了鉴定,并采用连续稀释法进行了克隆和建株。结果表明,采用含有马血清和米粉以及抗生素的M 199培养基,从病鸡盲肠中能分离到芽囊原虫、鸡四毛滴虫和火鸡组织滴虫,盲肠中混合感染且难以分离纯化单一虫种;从病鸡肝中能成功分离到火鸡组织滴虫单一虫种;通过有限稀释法成功获得了火鸡组织滴虫的单个克隆虫株,命名为JSYZ-A株。将分离的虫株通过泄殖腔回归接种14日龄黄羽肉鸡,成功复制出了组织滴虫病。本研究结果为进一步开展虫体致病机制、药物筛选和疫苗研制奠定了很好的基础。

火鸡组织滴虫不同地区分离株的致病性比较

为比较不同地区火鸡组织滴虫分离株的致病力是否存在差异,对2株火鸡组织滴虫虫株JSYZ-A和JSYZ-B通过人工感染试验进行了毒力评价。结果表明,感染后15d苏禽黄羽肉鸡泄殖腔感染虫体10^5个/只,感染后15d扑杀时发病率、病死率、增重、肝脏和盲肠病变计分等致病力评价指标2株虫体间存在差异:JSYZ-A株导致的发病率和病死率相比JSYZ-B株更为严重;与未感染对照组相比,2株虫株感染后均严重影响增重,其中JSYZ-A株对增重的影响稍大于JSYZ-B株,但2株间差异不显著(P>0.05);JSYZ-A株导致的肝脏和盲肠病变计分均比JSYZ-B株严重,其中肝脏病变计分存在显著性差异(P<0.05),盲肠病变计分差异不显著。不同地区火鸡组织滴虫分离株的致病力存在差异,筛选出的强毒株可用于致弱活疫苗的研制或虫体致病机理的研究。

组织滴虫病诊断技术的研究进展

火鸡组织滴虫引起的组织滴虫病对养禽业造成的经济损失巨大,建立有效的检测方法,对组织滴虫病的诊断、预防及控制具有重要的意义。本文对国内外火鸡组织滴虫的诊断方法和技术的研究进展进行了概括和综述。