产肠毒素大肠杆菌多重PCR检测方法的建立

为快速检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌(ETEC)菌毛(K88和K99)和毒素(STa)基因,本研究设计合成了针对K88、K99和STa基因的3对特异性引物,对K88、K99和STa基因扩增条件进行优化,建立了检测K88、K99和STa的多重PCR方法。该方法对K88、K99和STa基因的扩增产物分别为237 bp,314 bp和166 bp;此外,该方法具有良好的灵敏性和特异性。本实验建立的多重PCR方法为致幼畜腹泻ETEC的检测提供了快速准确方法。用所建立的多重PCR方法对实验室分离的23株大肠杆菌进行检测,结果 2株为K99/STa阳性,1株为STa阳性。

产肠毒素大肠杆菌双重PCR检测方法的建立

为了快速检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌菌毛(K88和K99)基因,本研究设计合成了针对K88、K99的2对特异性引物,对扩增条件进行优化,建立了检测K88和K99的双重PCR方法。该方法对K88、K99基因的扩增产物大小分别为237和314bp;最终确定dNTP终浓度0.4mmol/L,K88、K99的引物终浓度均为25μmol/L,退火温度为52℃。试验结果表明,该方法具有良好的灵敏性和特异性。用所建立的双重PCR方法对实验室分离的23株大肠杆菌进行检测,结果显示,K88单重PCR阳性2株,K99单重PCR阳性3株,K88和K99双重PCR阳性5株。本研究建立的双重PCR检测方法为致幼畜腹泻产肠毒素大肠杆菌的快速准确检测提供了方法。

猪繁殖与呼吸综合征重组病毒非必需基因区的鉴定

为鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的非必需基因区,本研究在高致病性PRRSV细胞致弱株感染性克隆Hu N4-F112的基础上,在其基因组ORF1b和ORF2a之间插入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,并在外源基因3'端下游插入该病毒的转录调控序列6(TRS6),构建PRRSV-EGFP感染性克隆。将其体外转录制备的病毒全长RNA转染Marc-145细胞后,拯救获得了表达EGFP的重组病毒(r Hu N4-F112-EGFP)。将r Hu N4-F112-EGFP在Marc-145细胞中进行连续传代至20代,其外源gfp基因仍能够持续表达,表明该重组病毒具有良好的遗传稳定性。与亲本病毒Hu N4-F112相比,重组病毒在病毒滴度、空斑形态等方面差异不显著;病毒生长曲线的结果显示,重组病毒具有良好的增殖能力。本研究结果表明,在PRRSV的ORF1b和ORF2a基因区中插入外源基因并未影响该病毒体外复制,该非必需基因区的鉴定为进一步研究以PRRSV疫苗为活病毒载体多价重组疫苗的研发奠定基础。

重组猪瘟病毒C株E2蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建及鉴定

本研究在猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)弱毒株(Hu N4-F112)感染性克隆的基础上,在其基因组ORF1b和ORF2之间插入(classical swine fever,CSF)疫苗毒C株的E2基因,并在E2基因3'端下游插入PRRSV的转录调控序列6(transcription regulatory sequence 6,TRS6),构建成重组全长感染性克隆(p A-C-E2)。用SwaI线性化该质粒,并体外转录后,将RNA转染MARC-145细胞并传代1次,即可拯救出重组病毒vA-C-E2,在至少20代的传代过程中能够保持遗传稳定性。重组病毒与亲本病毒vHu N4-F112在病毒滴度、空斑形态、蛋白表达等方面没有明显差异;多步生长曲线结果显示,该重组病毒与亲本毒具有相似的生长特性。间接免疫荧光(indirect immunofl uorescence,IFA)结果显示,重组病毒不仅能够表达PRRSV N蛋白,也可以表达猪瘟病毒E2蛋白。本研究结果为研制CSF和PRRS新型基因重组疫苗奠定了坚实物质基础。

PRRSV强弱毒体外诱导IL-10产生差异的分子基础研究

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染后能够引发机体产生免疫抑制,IL-10在病毒介导的免疫抑制中起重要作用。PRRSV HuN4株感染PAM细胞后能够诱导IL-10高水平表达,而其传代致弱毒株HuN4-F112感染PAM细胞后IL-10表达水平很低。本研究以PRRSV HuN4株及HuN4-F112株为研究对象,对其感染PAM细胞后IL-10上游关键因子表达差异进行研究,揭示诱导IL-10产生差异的分子基础。结果显示,PRRSV强弱毒感染PAM细胞后,强毒HuN4株诱导TLR2与TLR4转录水平显著高于弱毒HuN4-F112株,TLR3、TLR7和TLR9转录水平则无显著差异;强毒HuN4株感染PAM细胞后,其p38磷酸化水平显著高于弱毒HuN4-F112株,而ERK磷酸化水平差异不具备显著统计学意义。结果提示,PRRSV强弱毒株感染PAM细胞诱导IL-10表达水平的差异推测是由于强弱毒诱导p38 MAPK磷酸化水平差异造成的。

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染肺泡巨噬细胞后差异表达膜蛋白的鉴定与分析

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是危害养猪业发展的重要传染病之一。2006年我国首次爆发高致病性PRRS(highly-pathogenicPRRS,HP-PRRS),与经典的PRRS相比,HP-PRRS发病率和死亡率均显著升高。目前,对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly-pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)引起的高发病率和高死亡率的机制仍不清楚。本研究利用1MOI的EGFP标记的HP-PRRSV毒株HuN4(rHuN4-EGFP)和其体外传代致弱毒株HuN4-F112(rHuN4-F112-EGFP)分别感染肺泡巨噬细胞(pulmonaryalveolarmacrophage,PAM),24h后通过流式细胞术,从FITC通道收集被PRRSV强弱毒感染的PAM,提取膜蛋白进行Shotgun质谱分析。试验最终获得82个在强弱毒感染PAM过程中存在差异表达的膜蛋白。感染rHuN4-EGFP的样品与未感染样品相比,有72个蛋白特异表达;感染rHuN4-F112-EGFP的样品与未感染样品相比,有12个蛋白特异表达。通过GO分析发现,这些蛋白主要参与代谢、生物调节与细胞加工过程,大多数蛋白具有结合、催化活性。进一步在MARC-145细胞上过表达部分差异膜蛋白,发现其中前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9(proprotein coverteases subtilism/kexin 9,PCSK9)能明显抑制PRRSV强毒株和弱毒株的复制,Clusterin、Apoliprotein C-II能促进PRRSV强毒株复制。本研究表明利用Shotgun质谱技术鉴定出的差异表达膜蛋白对PRRSV复制有影响,深入分析PRRSV感染后差异表达的膜蛋白变化将有利于进一步明确其致病机制。