中国优质烤烟产区耕层土壤腐殖质组分特征

土壤腐殖质含量和组成影响烤烟的产量和质量。中国烤烟种植空间分布广泛,植烟土壤的成土因素和土壤类型复杂多样,但有关全国尺度的植烟土壤腐殖质组分特征的研究报道甚少。采集了中国12个优质烟叶产区47个代表性县市425个典型烟田的耕层(0~30 cm)土样,测定和比较分析了土壤腐殖质组分,并进行了聚类分区。结果表明:(1)腐殖质总碳量介于6.04~23.18 g·kg^-1,平均为13.91g·kg^-1;腐殖酸碳量、胡敏酸碳量、胡敏素碳量、富里酸碳量以及胡富比的范围分别为3.66~12.23g·kg^-1、1.41~6.17 g·kg^-1、2.38~10.95 g·kg^-1、2.24~6.99 g·kg^-1和0.45~1.03,平均分别为8.10 g·kg^-1、3.22 g·kg^-1、5.81 g·kg^-1、4.88 g·kg^-1和0.72。(2)腐殖质全碳量南岭山区显著高于其他地区,中原产区与鲁中山区显著低于其他地区;腐殖酸碳量、胡敏酸碳量和胡敏素碳量均以南岭山区为最高,鲁中山区均为最低;胡敏素含量攀西山区较高,但其他组分偏低。(3)依据腐殖质组分(6项指标)将47个县市产区分为四类地区,各类地区之间腐殖质含量和组分差异显著。

本氏烟NbNAC062的克隆及对马铃薯Y病毒侵染的抑制作用

【目的】马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是危害我国烟草生产的最重要病毒之一,NAC转录因子与植物的抗病、抗逆密切相关,本论文克隆NbNAC062进行生物信息学分析,并研究其在PVY侵染过程中的作用,为烟草抗病毒药剂的开发提供靶标。【方法】以本氏烟(Nicotiana benthamiana)为材料克隆NbNAC062,利用MEGA、UniProt、SMART、TMHMM Server 2.0、Sol Genomics Network、PlantCARE等技术进行生物信息学分析;利用激光共聚焦与实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)明确PVY侵染前后NbNAC062蛋白定位及mRNA表达量变化;基于病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)和过表达技术,构建pTRV::NbNAC062沉默载体与pEarleyGate100::RFP::NbNAC062过表达载体,采用qRT-PCR和Western blot检测NbNAC062在本氏烟中沉默与过表达后,PVY的积累量变化及未折叠蛋白应答(unfolded protein response,UPR)相关基因BiP的表达差异。【结果】NbNAC062编码646个氨基酸,N端28—179 aa为NAC结构域,129—185 aa为DNA结合区域,C末端621—643 aa为疏水跨膜结构,系统进化树与蛋白序列分析表明本氏烟NbNAC062与渐狭叶烟草NaNAC062亲缘关系最近。NbNAC062启动子中包含脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸以及逆境响应相关的多种顺式作用元件。PVY侵染激活NbNAC062从细胞膜转移至细胞核,且诱导NbNAC062上调表达。PVY侵染本氏烟5、7 d,处理组NbNAC062 mRNA水平分别为对照组的2.52、1.95倍;PVY侵染3 d,BiP mRNA表达量为对照组的2.39倍,PVY侵染7 d,BiP表达量极显著低于对照组,下调表达56.77%。本氏烟沉默NbNAC062并接种PVY,接种后3、5、7 d,与对照组相比,沉默组PVY CP mRNA上调表达,分别为对照组的2.12、2.41、1.38倍,BiP mRNA表达量则下调,分别下调28.19%、58.11%、10.77%,接种后5、7 d沉默组PVY CP蛋白含量亦显著高于对照组。过表达NbNAC062并接种PVY,接种后24、48、72 h,与对照组相比,过表达组PVY CP mRNA分别下调22.60%、34.51%、36.21%,接种48、72 h,BiP mRNA上调表达,分别为对照组的1.56、1.35倍,过表达组PVY CP蛋白含量亦低于对照组。【结论】NbNAC062属于NAC类膜结合转录因子,可被PVY侵染激活转移至细胞核,可能通过调控UPR相关基因BiP的表达,促进细胞生存,抑制PVY早期侵染。

荧光假单胞菌CZ菌株定殖及抗病毒活性研究

荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens CZ能分泌包括碱性磷酸酶在内的抗病毒蛋白抑制烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus(TMV)侵染。本文利用抗生素利福平逐级诱导获得抗药性标记菌株CZ-rif,生测试验显示:野生型和抗药型菌株的发酵上清和粗蛋白液对TMV的体外钝化效果均大于90%,无显著差异。灭菌和非灭菌的根际土拌CZ-rif菌液后盆栽烟苗,取根际土在含抗生素的平板上检测定殖菌量,结果显示,CZ-rif能够在烟株根际土壤中有效定殖,第31天在灭菌土中的定殖菌量为4.3×10^4 cfu/g,显著大于在非灭菌土中的定殖菌量6×10^3 cfu/g,在叶面上的定殖菌量显著低于根际土壤。叶面喷施CZ-rif菌液后24 h接种病毒,对TMV-GFP的预防效果为45.85%。田间试验中喷淋菌株发酵稀释液,对烟草花叶病毒病的防效为42.02%。此外,水培试验显示生防菌发酵液对烟草幼苗具有促生作用。总之,荧光假单胞菌CZ能在烟草根际定殖和促进植株生长,叶面喷施能钝化TMV并抑制其初侵染,可以研发防治病毒病害的生物制剂。

转录因子NbNAC062及其纳米药物对PVY侵染的抑制作用

前期研究表明NbNAC062能够抑制PVY早期侵染,本研究通过构建NbNAC062敲除突变体和过表达植株进一步明确NbNAC062的抗病毒功能,并利用异硫氰酸荧光素(fluorescein-5-isothiocyanate,FITC)标记的壳聚糖季铵盐(chitosan quaternary ammonium salt,HACC)包被NbNAC062质粒,制备HACC-NbNAC062纳米药物。激光共聚焦显微镜对纳米药物进行示踪;透射电镜和激光粒子分析仪对其表征进行分析。通过GFP荧光差异、qRT-PCR和蛋白免疫印迹检测病毒含量来探明纳米药物对PVY侵染的影响。结果显示,敲除组病毒GFP荧光增强,而过表达组病毒GFP荧光减弱,PVY CP含量与上述结果一致。纳米药物粒径集中分布在18~32 nm之间;Zeta电位为+41.8 mV。浸润纳米药物HACC-NbNAC062后48 h,在细胞内观察到FITC-HACC(绿色荧光)与RFP-NbNAC062(红色荧光);接种PVY-GFP后5、7、9 d,NbNAC062-HACC施药组的PVY CP mRNA水平较对照组分别下调17.41%、47.81%、13.03%;第7天施药组PVY CP蛋白水平明显低于对照组,病毒荧光强度显著暗于对照组。上述研究结果说明HACC-NbNAC062纳米药物成功递送了NbNAC062,并发挥了其对PVY初期侵染的抑制作用。

毒株、苗龄及温度对烟草苗期接种TMV试验的影响

病毒株系、苗龄、接种后培养条件是影响烟草病毒病发生发展的关键因素,为确保烟草接种TMV抗性鉴定和药效生测试验的准确性,在N基因烟草和普通烟草上接种TMV,采用病毒生物学、qRT-PCR和Western blot技术,研究病毒的分离纯化、株系、稀释限点、传导路径、病害症状,以及N基因抗TMV的温敏性。结果显示,TMV为U1株系,在K326上活体保存50~65 d,仍具有较强的致病力,稀释限点为10~5,接种物浓度以10~2稀释为宜。接种后TMV先由接种叶传导到主茎,向下至根、向上至心叶,然后是上部叶,最后传导至下部叶,12~16 d布满全株,21~28 d花叶畸形显著,病情调查宜在2~3周内。温度和苗龄影响N基因烟草对TMV的抗性反应,培养温度应在25℃~27℃,苗龄以6~7叶期为宜。