原代肾小管上皮细胞的提取和培养方法的优化

为建立理想的研究农药中毒性肾病体外细胞模型,系统考察了原代肾小管上皮细胞提取和培养的一系列关键因素,经过优化组合,提出了一种更为高效实用的原代肾小管上皮细胞提取和培养方法。通过显微镜明场观察肾小管节段组织形态和纯度,研究0.1%的Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶在15min和3h的时候对组织的消化情况以及Ⅱ型胶原酶作用0min,8min,15min,40min,1h,3h时组织消化情况。利用MTT比色法考察了鼠尾I型胶原,层粘连蛋白,基质胶对培养皿的包被情况对细胞增殖速率的影响,利用MTT比色法考察不同浓度的血清对细胞增殖速率以及细胞活性维持的影响,细胞免疫荧光法考察不同浓度血清对肾小管上皮细胞的Na^+/K^+ATPase表达的影响。结果表明:利用Ⅱ型胶原酶,消化15min可以获得较好的肾小管节段;利用基质胶包被培养皿是性价比最高的促进肾小管上皮细胞增殖的条件;观察到在细胞增殖期内,1%,2%,4%的血清浓度较0%和5%有较好的促进细胞增殖作用;在平台期内,2%,4%,5%的血清浓度较0%和1%有较好的细胞活性维持作用;第3天时,2%血清浓度培养的肾小管上皮细胞的Na^+/K^+ATPase表达最强;第14天时,1%和2%血清浓度培养的细胞的Na^+/K^+ATPase表达较好,最终确定血清最优浓度为2%。在优化条件下所获得的原代肾小管细胞的角蛋白18和碱性磷酸酶的表达呈阳性。经过上述系统优化,细胞生长周期由传统方法的4~7d缩短到2~3d,并且实现了传统方法无法实现的原代肾小管上皮细胞长期培养,时间长达14d,从而为农药中毒性肾病的深入研究奠定了坚实的基础。

SLC44A5对肺腺癌细胞迁移影响

肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤.SLC44A5是一种胆碱转运蛋白,其与肿瘤关系的相关报道较少.有报道显示其与肝癌的发生发展有关,然而其在肺癌中的作用尚未有相关报道.为探讨SLC44A5的影响,使用人肺腺癌细胞系H1299和H1792构建SLC44A5低表达细胞系,利用MTT法证明敲低SLC44A5会抑制细胞增殖.使用细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验证明敲低SLC44A5抑制细胞迁移.结果表明SLC44A5可能参与了肺癌的转移,具有成为肿瘤治疗分子靶点的潜力.

一种检测中药成分毒性的心脏芯片构建

为确定中药安全性,有必要对中药中各成分的量效毒关系进行研究.心脏毒性是新药研究中需要格外注意的器官毒性,为了解决孔板试验中缺少细胞间相互作用以及微环境与体内差异大的问题,构建了一种在体外模拟心肌细胞与毛细血管相互作用的心脏芯片,并使用该芯片检测了雷公藤甲素、氯化两面针碱、莨菪碱3种中药成分的毒性.通过对比加药前后芯片和孔板里心肌细胞的搏动状态变化,以及细胞培养液中乳酸脱氢酶和肌钙蛋白的含量变化,发现3种中药化学成分有剂量依赖的心脏毒性,同时发现芯片内的心肌细胞比孔板内的对于药物的耐受性更强,显示了本芯片用于检测药物心脏毒性的潜力.

基于便携拉曼光谱仪和双层纸芯片的头发皮质醇超高灵敏检测

人头发中的皮质醇是反映现代人长期精神压力累积的主要临床标记物.建立了一种人发皮质醇的超高灵敏检测方法.方法基于表面增强拉曼光谱、免疫分析和双层纸芯片.纸芯片的第一层用于滤除人发提取液中的头发残渣(样品前处理),第二层用于实施竞争性免疫反应和拉曼检测.固定在纸表面的皮质醇抗原和游离的头发皮质醇竞争结合能产生拉曼信号的皮质醇单克隆抗体,通过检测结合在纸表面的皮质醇抗原-抗体复合物的拉曼信号进行游离头发皮质醇的定量.在便携式拉曼光谱仪上,皮质醇抗体的拉曼信号经过优化,方法的检测限可以达到1 pg/mL,平行测定相对标准偏差为8.38%(n=6).进行了两例实际样品检测,液质检测结果分别为0.771和0.153 ng/mL,本方法检测结果分别为0.63和0.247 ng/mL,两种方案的结果在一个数量级,证明了方法的实用性.利用此方法,一块芯片可以同时测定48个样品,专属性和准确性很好,特别适合于人群精神压力的普查.