白藜芦醇缓解NEFA诱导的奶牛乳腺上皮细胞的周期阻滞和凋亡

围产期奶牛能量负平衡(negative energy balance, NEB)可引起高非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids, NEFA)血症。大量NEFA被乳腺组织吸收,可诱发细胞凋亡。白藜芦醇(resveratrol, RES)是一种非黄酮类多酚有机化合物,具有抗炎抗凋亡等作用。目前,尚不清楚RES对高NEFA处理的乳腺上皮细胞(MAC-T)的周期阻滞和凋亡的影响。因此本研究主要探讨NEFA对MAC-T细胞周期阻滞和凋亡的影响以及RES是否能改善高浓度NEFA对MAC-T的病理作用。添加不同浓度的NEFA处理MAC-T,利用CCK-8细胞活力检测试剂盒检测细胞活力,通过Western blot检测细胞凋亡相关分子Caspase-3、Bcl-2、Bax和细胞周期调节因子Cyclin D1的蛋白表达水平,采用qRT-PCR法检测细胞凋亡相关因子Caspase-3、Bcl-2、Bax的mRNA转录水平,利用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。结果显示,NEFA剂量依赖性地诱导MAC-T细胞凋亡,降低细胞活力,阻滞细胞周期。高NEFA显著增加Bax、Caspase-3的mRNA转录水平和Bax/Bcl-2、cleaved-Caspase-3/Caspase-3蛋白表达,降低细胞周期调节因子Cyclin D1的蛋白表达及Bcl-2 mRNA转录水平。此外,单独添加最高浓度80μmol/L的RES对MAC-T细胞活力无影响,且不会引起细胞凋亡。用高浓度NEFA处理细胞并分别添加10、20、40μmol/L RES,RES的添加可以缓解NEFA导致的Cyclin D1蛋白水平下降,降低Bax/Bcl-2和Cleaved-Caspase-3/caspase-3蛋白水平。同时,RES的添加还可以降低G2/M和S期细胞百分比和细胞凋亡。结果表明,NEFA可以引起细胞周期阻滞和细胞凋亡,RES能缓解NEFA诱导的MAC-T细胞周期阻滞和细胞凋亡。

维生素E类似物对NEFA处理的奶牛乳腺上皮细胞乳脂乳蛋白合成和氧化应激的影响

应用高浓度非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids,NEFA)处理MAC-T细胞并添加α生育酚,采用Western blot技术检测乳脂乳蛋白合成相关关键蛋白的表达,并利用生化试剂盒检测细胞中TG和MDA含量,通过酶活试剂盒检测细胞SOD、CAT和GSH-Px酶活性。结果显示,在1.2 mmol/L NEFA作用下,MAC-T细胞β-casein蛋白表达以及乳蛋白合成相关蛋白mTor和S6K1磷酸化水平降低,细胞TG含量和合成相关蛋白SREBP1蛋白表达升高,同时氧化产物MDA含量升高,抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活性降低,表明高浓度NEFA可以诱导奶牛乳腺上皮细胞发生氧化应激,并抑制乳蛋白合成,促进乳脂合成。用1.2 mmol/L NEFA处理细胞并添加10μmol/Lα生育酚,发现α生育酚可以缓解NEFA导致的β-casein蛋白水平下降,恢复mTor和S6K1磷酸化水平,降低细胞TG含量和SREBP1蛋白表达。同时,α生育酚还可以降低细胞MDA含量,升高SOD、CAT和GSH-Px的活性。结果表明,维生素E类似物可以降低高NEFA引起的乳腺上皮细胞氧化应激水平,缓解NEFA对乳脂乳蛋白合成的影响。