ITR缺陷对AAV病毒包装与感染力的影响

腺相关病毒(AAV)是一种复制缺陷性DNA病毒,其基因组两端的两个倒转末端重复序列(ITR)是rAAV包装复制所必需的自身结构.ITR容易缺失并影响病毒颗粒的包装和感染力.比较两个ITR完整的和一端ITR缺失的AAV病毒发现,一端ITR缺失的AAV载体质粒包装病毒的效率明显比ITR完整的质粒低.用这两种AAV病毒感染293细胞、HeLa细胞和小细胞肺癌细胞NCI H446细胞,显示两个ITR完整的AAV病毒感染细胞的能力明显比一个ITR缺失的病毒强.说明ITR缺失对AAV病毒的包装和感染力都有明显的影响.因此,筛选两个ITR完整的AAV载体质粒,并稳定其基因组的结构,对提高病毒生产的产量和增强病毒的感染力都有显著的价值.

人ZP3B-细胞表位嵌合肽DNA的设计和合成

目的 :设计和合成适合在昆虫细胞中表达的一个人ZP3B细胞表位的DNA序列。方法 :根据国外的研究基础 ,设计由人ZP3的B细胞表位肽段和外源Th细胞表位肽段串联而成的 4 5肽嵌合肽序列 ,并根据昆虫细胞对密码子的偏爱性设计出该嵌合肽的DNA序列。然后人工合成该嵌合肽的DNA链 ,并克隆到PUC18载体上。结果 :通过酶切分析和测序证明 ,合成的DNA与所设计的嵌合肽DNA序列一致。结论 : 按设计合成了人ZP3的B细胞表位和外源Th细胞表位串联而成的嵌合肽DNA序列。

有效分离1kDa小肽的Tricine-SDS-PAGE方法

为了建立能有效分离 1kDa的特小分子肽的Tricine SDS PAGE方法 ,调整分离胶中聚丙烯酰胺凝胶的分子组成 ,使致密胶中丙烯酰胺和双丙烯酰胺的交联度为 5 %,并加入 36 5 %的尿素 ,用于分离小至 1kDa的小分子肽 ,并与常规的SDS PAGE和先前报道的Tricine SDS PAGE相比较。结果改进的致密胶可以有效分离分子量小至 1kDa的小肽 ,明显优于常规的SDS PAGE和现有的Tricine SDS

8型AAV重组病毒介导的凝血因子的基因表达

8型AAV重组病毒载体是新型的基因转移载体,能高效转染肌肉细胞和肝细胞.AAV转染细胞的效果与注射病毒的途径有很大关系.与门脉注射和肌肉注射相比,经腹腔注射的rAAV8病毒能经血液循环转运到全身其他组织器官,形成更加广泛和持久的基因转导.通过腹腔途径把5×1010gc的8型重组病毒载体注射到小鼠体内,2周后,小鼠血浆中有明显的基因表达,1个月至2个月期间多数小鼠表达量达到高峰,然后表达水平下降,直到4个月后血浆中尚维持明显的表达量.凝血实验显示,表达的人凝血因子Ⅸ具有生物活性.免疫组化实验显示,病毒载体已进入体内多组织器官中表达.说明8型AAV病毒载体经腹腔注射后已经血液循环运送到其他组织,并在肌肉、肝脏、肾脏和心脏等器官明显表达,表达产物具有凝血活性.

小鼠附睾精子的显微受精

目的 :建立显微受精的方法 ,并探讨小鼠附睾精子在显微注射进入卵母细胞后的受精能力。方法 :用显微注射法把小鼠附睾头和附睾尾精子注入卵母细胞的胞质内或卵周隙进行显微受精。结果 :把单个附睾尾精子注入卵细胞质中 ,培养后 14个存活的卵细胞中 ,有 5个卵裂为 2 -细胞期胚胎 ;将单个附睾头精子注入卵母细胞中 ,有 2 5个存活 ,其中 9个受精发育为 2 -细胞期胚胎 ;将附睾尾精子注入卵周隙进行带下受精 ,30个存活的卵细胞中有 4个卵裂为 2 -细胞期胚胎。结论 :建立的显微受精技术能用附睾精子受精 ,但受精率有待提高。

尿素改善SDS-PAGE分离小分子肽的效果

目的 :探讨尿素对Tricine-SDS -PAGE系统分离小分子蛋白的影响。方法 :利用常规SDS -PAGE和Tricine -SDS - PAGE分离小分子肽 ,比较不同组成的分离胶的分离效果。结果 :调整聚丙烯酰胺凝胶的分子组成 ,使丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联度为 5 .0 5 % ,能够改善小分子肽的分离效果。加入 36 %的尿素比加入甘油可以更有效分离 1kD的小肽。但尿素胶聚合太快影响分离效果。结论 :尿素改善SDS -PAGE分离小分子肽的效果 ,制作尿素胶时 ,宜采用低浓度的AP和TEMED使凝胶慢速聚合。

ZP2抑或ZP3——精卵识别机制的争辩

本文综述受精研究的新进展,精子与卵透明带的识别是受精过程中的一个关键过程。自从上世纪七十年代以来,国际上有关实验室对受精机理进行了系统的研究,取得了明显的进展,建立了精卵识别的经典理论,认为卵透明带ZP3是精子的初级受体与顶体反应的诱导剂。然而,近年来的深入研究结果与原来的理论发生明显冲突,使得原来清晰的阐述变得迷糊,原来顺理成章的结论重新变成疑点。

线粒体病的基因治疗

线粒体基因突变导致的线粒体病仍是不治之症,目前只有针对症状的支持性疗法。根治线粒体病只能寄希望于基因治疗。基因治疗的主要目标是修补特定基因突变导致的功能缺陷,或促使异质性的转变,以降低突变型与野生型基因组的比例。所探讨的途径主要包括:①在肽核酸和锌指肽的引导下选择性抑制突变基因组的复制;②利用特定的限制性内切酶去除突变的线粒体基因组;③把特定的tRNAs输入线粒体;④把异位表达的线粒体多肽输入线粒体。但临床上基因治疗线粒体病还需更多的研究。

不同成长背景的华裔大学生性观念和性行为调查

目的:了解不同成长背景的现代华裔大学生性观念和性行为的状况。方法:对暨南大学不同成长背景的华裔本科生群体进行问卷调查,比较来自港澳台、海外、大陆城市、大陆乡村的男生和女生的性观念和性行为的差异。结果:大多数大学生认为目前大学生婚前性行为很普遍,57%的学生接受婚前性行为,61.7%的学生可以接受配偶以往的性经历。婚前性行为发生比例外招生高于大陆学生,3.45%的女大学生经历过意外妊娠。生理需要是大学生婚前性行为的主要诱因,婚前性行为对大学生的主要困扰是意外妊娠。结论:当代大学生的性观念很开放,成长环境对性观念和性行为有较大的影响。大学生的避孕知识需加强。

糖蛋白PAGE分离后的糖基显色法

鸡卵清蛋白通过SDS-PAGE分离后,用过碘酸-希夫(PAS)显色法可以使卵清蛋白显红色,而用糖苷酶去除卵清蛋白的糖基可以去除相应的红色。考马斯亮兰染色结果显示,去糖基后的卵清蛋白分子量略有减小。可见,PAS可方便地使糖蛋白呈现红色。

受精前后卵透明带糖蛋白的生化特性差异

探讨受精后卵透明带糖蛋白的生化特性变化 .用SDS PAGE分析未受精卵和 2 细胞胚胎的透明带成分的差异 .研究结果表明 ,受精前后卵透明带的主要带型相似 ,但 2 细胞胚胎透明带在还原电泳中有一条特异的小肽 ,分子质量在 15 0 0 0～ 30 0 0 0之间 ,约为2 2 0 0 0 .进一步用HPLC分析两种样品的O 侧糖链的不同 ,分析显示 ,两种样品的O 糖链中有 3种单糖基的保留时间值很相似 ,但有些寡糖基明显不同 .小鼠透明带精子受体失活的分子机制主要在于O 寡糖链的修饰 ,O 单糖与精子受体失活没有明显的关系 .

不明原因不育症患者的抗精子抗体分析

目的分析不明原因不育患者血清中抗精子抗体的发生率。方法筛选不明原因不育夫妇病例 ,用ELISA检测不育患者血清中的抗精子抗体。结果患者血清共 15 3份 ,8份阳性 ,占 5 .2 3%,其中男性血清阳性率为 3.6 4%(2 / 5 5 ) ,女性血清阳性率为 6 .12 %(6 / 98) ,没有发现夫妻双方同时阳性的病例。结论不明原因不育患者的血清抗精子抗体发生率较低 ,而男性患者的阳性率比女性患者的阳性率更低。

不明原因不孕症妇女的抗透明带抗体分析

目的 :分析不孕妇女血清中抗透明带抗体的发生率。方法 :筛选不明原因不孕妇女病例 ,用 EL ISA检测不孕妇女血清中的抗透明带抗体。结果 :检测的 54例不明原因不孕症患者血清中 ,仅 1例血清抗体 Index值 >1 .0 ,为阳性。结论 :不明原因不孕妇女的血清抗透明带抗体发生率很低 ,阳性血清抗透明带抗体是否影响受精和生育有待于进一步研究。

杆状病毒表达的hZP3 B细胞表位嵌合肽的免疫活性研究

为研究杆状病毒系统表达的人透明带ZP3的B细胞表位嵌合肽(BCP)的免疫原性及其抗血清与人透明带的免疫交叉反应,重组z3bcp病毒用于感染sf9细胞以表达BCP。Tricine＿SDS＿PAGE用于分离感染液中的小相对分子质量表达产物,表达产物用于免疫小鼠制备抗血清,免疫细胞化学试验用于检验抗血清与人卵泡透明带的交叉反应性。结果显示,sf9细胞被z3bcp病毒感染后,培养液中分离出一条相对分子质量约为6000的特异带,而正常sf9细胞中没有等同的带。免疫细胞化学试验结果显示,该特异肽的抗血清能与人透明带特异结合,表明人透明带BCP嵌合肽在杆状病毒系统中成功表达,表达产物具有抗原性,抗血清能与人透明带特异结合。

染色质重组试管婴儿

日益发展的体外受精技术正广泛应用于临床不孕症的治疗 ,但可能造成缺陷基因下传 .胚胎着床前遗传诊断技术可早期诊断胚胎遗传缺陷 ,减少遗传病胎儿的妊娠 ,但不能修正患儿的基因缺陷 .在此 ,作者提出染色质重组试管婴儿的构想 ,即在体外受精时剔除有缺陷的染色体 ,再植入其他个体相应的正常染色体 ,从而达到修正胎儿遗传缺陷 。

人ZP3的N端肽的体外表达

目的：为了深入研究透明带的功能，体外表达人ZP3的N 端肽段。方法：通过PCR克隆人ZP3的第77～703的DNA序列，利用该片段构建hZP3的N端肽的原核表达载体，转化大肠杆菌Rosetta （DE3）进行体外表达，利用分离的表达产物免疫小鼠，通过ELISA检测抗体反应，利用Western blotting和免疫组化检测抗血清与重组透明带蛋白和人卵巢天然的透明带蛋白的特异反应。结果：Western blotting结果显示，获得了约27 ku的重组蛋白，用该蛋白免疫小鼠获得了抗体滴度近20000的抗血清，该抗体能与重组透明带蛋白和人卵巢天然的透明带蛋白的特异反应。结论：成功表达人ZP3的N端重组肽，表达产物具有免疫原性。

一步性冷冻解冻法保存小鼠胚胎初探

对不同胚龄(2,4和多细胞期)的小鼠胚胎的一步性冷冻保存效果做了实验比较。用不同比例的甘油和1,2-丙二醇为冷冻保护剂,蔗糖为解冻稀释液,以37℃,5％CO_2条件下能发育到囊胚期为胚胎保持正常生命力的指标。结果表明,在所用的不同组合的保护剂中,含2.5mol/L甘油和3.5mol/L 1,2—丙二醇的CP5效果最好。以它作冷冻保护剂一步性液氮保存多细胞期(指8～16细胞期或稍晚)胚胎,35℃水浴解冻后,平均有37.8％的发育至囊胚。用此法保存4细胞和2细胞期小鼠胚胎效果差。25℃和15℃水浴解冻也明显不如35℃解冻效果好。