一株蒽降解菌的分离筛选及降解特性初析

多环芳烃(PAHs)是土壤中最常见的典型持久性有机污染物,蒽作为其典型代表,常被用作降解PAHs的模型化合物和检测PAHs污染的指示物。采集北京郊区受污染土样,通过驯化和富集,分离出185株具有蒽降解潜力的菌株,采用高效液相色谱法定量测定菌株的蒽降解效率,筛选获得一株可高效降解蒽的菌株R4004-2。经菌落形态观察、16S rRNA和gyrB基因系统发育分析、基因组框架图ANI、DDH和dDDH值分析,确定R4004-2为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)。菌株R4004-2以蒽为唯一碳源,对蒽的降解率可达82.3%,在肉汤培养基中的生长速度最快。在蒽含量为0.25 mg/kg的污染土壤中,施氏假单胞菌R4004-2可以有效定殖,具有修复污染土壤的潜力。基于转录组以及代谢组结果,施氏假单胞菌R4004-2通过双加氧酶进行对蒽的第一步氧化,后续分别通过蒽醌的氧化以及1-羟基-2-萘甲酸酯的分解两个途径完成对蒽的降解,初步解析了其降解机制。

花生根瘤菌的数值分类

从我国 １１个省、 １６种土壤类型、 ２０多个花生（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ Ｌ．）品种上分离到的花生根瘤菌［Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．（Ａｒａｃｈｉｓ）］中选取５０个代表菌株、并与从津巴布韦引进的４株花生根瘤菌及７株慢生根瘤菌常用的参比菌株共６１株菌进行了１２８项表型特征的测定。数值分类的结果表明，全部菌株在７５％水平上相聚，并在７６％和７７％的水平上分别聚成两大群（群Ⅰ、群Ⅱ），每大群以较高的相似性（８５％- ９４％）各聚成６个亚群。所用数值分类方法不能将花生根瘤菌和大豆根瘤菌在属的水平上分开，但亚群和未归入亚群的菌株可能暗示亚种或种存在，同时本文结果还表现出花生根瘤菌的地域分布差异及其多样性。

日本及一些国家对微生物肥料产品的管理

微生物肥料（接种剂，菌肥）以其独特的作用机制和作用效果已在７０多个国家进行研究、生产和应用。加强菌肥产品的管理对于各个国家规范这个行业的生产有着十分重要的意义。本文介绍了日本、澳大利亚、英国、法国、加拿大等国家在这方面的经验和教训，以利于我国有关单位进行微生物肥料的管理，促进该行业的健康发展。

应用多重PCR鉴定微生物肥料常用芽孢杆菌

【目的】枯草群芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)是微生物肥料中常用菌种,用传统方法鉴定费时费力,有必要建立检测和鉴定这些芽孢杆菌的种特异性PCR方法。【方法】利用已登录的gyrA、rpoA和16SrRNA基因序列分别设计和筛选上述菌种的特异引物并建立多重PCR反应体系。【结果】以基因组DNA为模板,扩增芽孢杆菌、类芽孢杆菌和短芽孢杆菌3属15种的标准菌株(共33株),4个目标种分别产生了大小不同的唯一的产物,除个别种与短小芽孢杆菌引物有交叉反应外,其余参考菌株均为阴性。从23株枯草群菌株的基因组DNA扩增发现,PCR鉴定与常规鉴定结果一致。【结论】本文建立的多重PCR方法具有较好的特异性,可快速准确鉴定枯草群的4个种,在微生物肥料检测方面有良好的实用前景。

应用PCR技术检测微生物肥料产品的初步研究

微生物肥料产品中的微生物种类多种多样．将各种微生物准确鉴别出来是产品检测和质量判定的依据。常规的检测方法是根据菌落、菌体特征结合菌种鉴定材料进行判断．而面对表型特征不明显或含有多种微生物的样品时容易出现误判现象．此时必须结合生化试验或一些仪器设备对菌种进行辨认。传统的生理生化试验耗时费力．BIOLOG快速鉴定系统、脂肪酸分析法等测定繁琐、成本高．这些方法不能满足肥料检测中的快速、准确的需要。

根瘤菌与促生菌双接种对大豆生长和土壤酶活的影响

【目的】慢生大豆根瘤菌和胶质类芽孢杆菌单一菌株固氮或促生效果及机理已有较多研究,但两者双接种对作物的作用和增产机理尚未有所报道。本研究以慢生大豆根瘤菌5136与胶质类芽孢杆菌3016为研究对象,通过田间小区试验研究根瘤菌与促生菌不同施用模式对大豆生长和土壤酶活的影响,以期为开发新型高效复合菌剂提供理论依据。【方法】试验设对照(T1)、接种胶质类芽孢杆菌3016菌剂(T2)、接种慢生大豆根瘤菌5136菌剂(T3),胶质类芽孢杆菌3016和慢生大豆根瘤菌5136双接种(T4)和常规施肥(T5)5个处理,分别于大豆不同生育期调查大豆的农艺性状和结瘤状况,测定土壤酶活性,用BOX-PCR技术监测慢生大豆根瘤菌5136的占瘤率。【结果】1)在大豆成熟期,双接种(T4)处理的大豆单株分枝数、单株粒数、收获指数和产量均为最高,分别比T1高11.3%、9.7%、41.0%和9.3%,且单株空荚数最低,比T1降低了44.0%。2)在花荚期,双接种(T4)处理的占瘤率为25.4%,比T3处理高8.0%,且单株根瘤数和单株根瘤干重均为最高,分别比T1高41.6%和47.1%;说明双接种处理下,胶质类芽孢杆菌3016能够促进慢生大豆根瘤菌5136结瘤固氮。3)接种微生物菌剂均可不同程度地提高土壤酶活性,以双接种(T4)处理的效果最为显著,在大豆成熟期,土壤过氧化氢酶、脲酶和蔗糖酶活性均为最高,分别比对照高12.9%、8.9%和9.4%。4)相关性分析表明,土壤酶活性与大豆收获指数显著正相关或极显著正相关(P<0.01或P<0.05),其中过氧化氢酶与产量显著正相关;单株根瘤数和单株根瘤干重均与收获指数和蔗糖酶活性呈极显著正相关,与产量呈显著正相关。【结论】慢生大豆根瘤菌和胶质类芽孢杆菌双接种可以促进大豆生长,显著增加大豆的单株分枝数、单株粒数、收获指数和占瘤率,降低单株空荚数,增加大豆产量,同时可显著提高相关土壤酶活性,是一种节本增效的农艺措施。

长期有机无机肥配施对东北黑土真菌群落结构的影响

【目的】分析长期有机无机肥配施对土壤真菌丰度、多样性及其群落特征的影响,探讨东北黑土真菌群落变化与施肥的相关性,为进一步调节土壤微生物结构,改善其生态功能提供参考依据。【方法】依托黑龙江省农业科学院36年长期定位试验站,选取4个不同施肥处理:不施肥处理(CK)、有机肥处理(M)、氮磷钾无机肥处理(NPK)和有机肥配施无机肥处理(MNPK)的耕作层土壤为研究对象,以真菌ITS基因为分子标靶借助q PCR技术和Illumina Miseq高通量测序平台,研究不同施肥处理对黑土中真菌群落丰度、多样性和组成的影响,并与土壤化学性质进行偶联分析,揭示群落与施肥的相关性。【结果】长期施用无机肥显著降低土壤p H,而有机无机配施可以有效缓解土壤酸化。NPK处理的ITS基因丰度显著高于MNPK;MNPK处理的细菌/真菌比值(26.91×104)显著大于NPK,各处理比值由高到低为MNPK>M>CK>NPK。细菌/真菌比值与土壤p H正相关;MNPK处理的真菌α多样性指数值略大于NPK。Ascomycota和Zygomycota为土壤中主要真菌门,不同施肥处理之间真菌组成的相对丰度存在显著差异,对照处理Ascomycota的相对丰度为45.35%,MNPK和NPK处理分别为50.93%和56.16%。有机肥有利于降低病原真菌相对丰度,具有高度侵染性的Cochliobolus在MNPK(0.41%)和M(0.39%)中的相对丰度显著小于CK(3.25%)和NPK(2.08%)。CCA分析表明,土壤理化性质共解释土壤真菌群落结构变化的73.3%,有效磷(贡献量为32.4%,P=0.002)、铵态氮(贡献量为14.8%,P=0.01)和硝态氮(贡献量为16.2%,P=0.048)是3个重要的影响因子。【结论】不同施肥条件下土壤真菌丰度、多样性,以及菌群组成特征不同。与无机肥相比,有机肥无机肥配施能够有效改善真菌群落结构,降低真菌的丰度,增加真菌多样性,并提高土壤p H,减缓土壤酸化。土壤有效磷、铵态氮和硝态氮含量是影响黑土土壤真菌群落结构变化重要因素。

东北黑土微生物群落对长期施肥及作物的响应

【目的】为表征长达35年轮作与施肥条件下东北黑土微生物群落特征,解析长期施肥及作物对土壤微生物丰度和群落结构的影响,探讨东北黑土微生物群落变化与施肥及不同作物间的相互关系,为进一步改良耕作制度与施肥方式提供依据。【方法】依托黑龙江省农业科学院长期定位试验站,选取玉米和大豆两种作物季的4个不同施肥处理：不施肥处理（CK）、有机肥处理（M）、无机肥处理（NPK）和有机肥配施无机肥处理（MNPK）的耕层土壤为研究对象,处理前加字母m表示玉米季样品,加字母s表示大豆季样品。借助Illumina Miseq高通量测序平台和Real-time PCR技术,以16S rRNA基因为分子标靶,研究作物与施肥方式对黑土中微生物群落结构和丰度的影响,分析群落变化与土壤化学性质的相关性。【结果】玉米季土壤16S rRNA基因拷贝数（6.32×10^8—8.83×10^8/ng DNA）比大豆季的低（0.96×10^9—2.30×10^9/ng DNA）;玉米季土壤微生物多样性（ACE指数为3 674.58—4 034.84）也低于大豆季（ACE指数为4 167.47—4 887.36）;玉米季的细菌丰度以Acidobacteria（24.47%—27.90%）最高,而大豆季丰度最高的是Proteobacteria（27.78%—34.40%）,Bacteroidetes和Actinobacteria丰度在两季作物中差异明显。同一作物季的有机肥无机肥配施处理的16Sr RNA基因拷贝数高于无机肥处理,且有机肥配施无机肥处理的微生物α多样性指数也比无机肥处理的高（sMNPK的Chao1指数比sNPK高出11.89%）;不同施肥处理之间群落组成存在差异,Alphaproteobacteria在sMNPK和sNPK处理的相对丰度分别比sCK增加3.31%、5.24%;Gammaproteobacteria在sMNPK和sNPK处理均比sCK处理增加1.72%和1.2%,二者相对丰度变化大。相关性分析显示,16Sr RNA基因拷贝数与土壤硝态氮和速效钾正相关;微生物菌落多样性指数与土壤全氮、硝态氮、铵态氮、有效磷和速效钾等化学性质密切相关。【结论】东北黑土不同作物季和不同施肥均会影响土壤微生物丰度、α多样性和群落结构。有机肥无机肥配施能够有效改变微生物群落结构,提高微生物的丰度和多样性,并提高土壤p H,减缓土壤酸化。

甘草内生细菌多样性研究

以分离培养的方法对内蒙古鄂尔多斯市甘草基地野生及栽培甘草内生细菌的多样性进行了初步研究。结果表明,野生及栽培甘草植株内存在大量种群丰富的内生细菌。经ERIC-PCR指纹图谱分析,共分离到120株内生细菌,野生及栽培甘草均表现出根和叶部位的内生细菌数量多于茎部。对其中82株进行16SrDNA片段测序分析,结果表明这些内生细菌分别与GenBank中α、β、γ-Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria五类细菌中的19个已知属相似性达到97%～100%。内生细菌的主要优势种群为芽孢杆菌属(Bacillussp.)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、泛菌属(Pantoeasp.)和沙雷氏菌属(Serratiasp.)。

我国生物有机肥的发展现状及展望

概述了我国生物有机肥的研发由来和目前的生产应用现状,阐述了生物有机肥生产工艺、使用菌种、产品质量以及使用效果和作用机理。同时,指出了生物有机肥发展中存在的一些问题及解决的建议,并对生物有机肥的发展作了展望。

不同施肥处理对玉米产量及土壤酶活性的影响

分析了不同施肥处理对玉米产量和土壤养分的影响,以及不同生育期内土壤纤维素酶、脲酶和过氧化氢酶的动态变化。结果表明,5个不同施肥处理产量均高于CK;秸秆配施无机肥加秸秆腐熟剂(FS)处理和有机肥配施70% NPK(OF)处理的效果最佳,有机无机复合肥(OI2)、有机无机复合肥(OI1)和常规无机肥(CF)处理次之,不施肥处理(CK)最低。FS处理较常规施肥处理提高了4.87%,有机肥配施70%常规无机肥(OF)处理较常规施肥处理的产量提高了3.39%。施肥处理均能提高3种酶的活性,并且表现出较强规律性:土壤过氧化氢酶在玉米拔节期出现活性高峰,土壤纤维素酶和土壤脲酶在玉米大喇叭口期出现活性高峰;FS处理在各个时期的酶活性较高。综上所述,秸秆还田配施化肥加秸秆腐熟剂有利于增加土壤酶活性与土壤养分含量,提高作物产量。

长期施用氮肥和磷肥对东北黑土丛枝菌根真菌群落组成的影响

【目的】丛枝菌根(Arbuscular mycorrhizae,AM)真菌在促进作物养分吸收、提高作物抗病和抗逆性等方面具有重要意义,探讨长期施用化学氮肥和磷肥对东北黑土AM真菌的影响及其主效环境因子,为进一步揭示AM真菌对化肥的响应机制,指导农田施肥以及利用AM真菌提高土壤养分有效性提供依据。【方法】以长期定位试验为平台,选取5种不同处理:不施肥(CK),单施常量氮肥(N_1),混施常量氮肥和磷肥(N_1P_1),单施2倍常量氮肥(N_2),混施2倍常量氮肥和磷肥(N_2P_2)。采用Illumina Miseq高通量测序技术研究连续施用37年氮肥和磷肥的AM真菌群落组成差异,并对AM真菌群落组成与环境因子进行相关性分析。【结果】随着氮、磷施用量的增加,黑土p H和速效钾含量显著降低,而全氮、硝态氮、铵态氮和有机质含量显著提高。单施氮肥(N_1和N_2)对黑土中AM真菌多样性影响不显著(P>0.05);然而氮、磷混施(N_1P_1和N_2P_2)显著降低黑土中AM真菌多样性(P<0.05)。土壤中AM真菌以Glomeraceae科为主,占AM真菌45.5%。在属水平上,施肥降低Funneliformis和Septoglomus丰度,而提高Paraglomus丰度;在N_1和N_2基础上施磷显著提高Glomus和Funneliformis丰度,而降低Gigaspora和Paraglomus的丰度。非度量多维度分析表明,长期施用氮、磷肥改变了土壤中AM真菌群落组成。不施肥处理、单施氮肥处理和氮、磷混施处理AM真菌群落差异显著,且磷肥影响较为显著。冗余分析表明,土壤p H,有效磷含量是影响黑土中AM真菌群落组成的主效环境因子(P<0.05)。【结论】长期施用氮肥以及氮、磷肥混施改变了黑土中AM真菌群落组成,单施氮肥对黑土中AM真菌多样性影响不大,而氮、磷肥混施降低其多样性,施肥导致的土壤p H和有效磷含量变化是主要因素。

花生根瘤菌的抗逆性初步研究

对３９株花生根瘤菌（其中６株为引进菌株）和９株参比菌株进行干旱、ＮａＣｌ、ｐＨ及低温的耐受性实验。结果表明我国花生根瘤菌资源中存在着耐盐、酸较强的菌株，且耐受性水平差异较大；在８℃条件下供试菌株未见生长；花生根瘤菌有着比大豆根瘤菌更强的抗干旱能力，抗干旱能力同耐盐能力之间没有明显的关系。另外，菌株的抗逆性同共生特性、分离地之间也未见有明显的关系。

黄土高原地区优良大豆根瘤菌的筛选与接种方式研究

采用蛭石和土壤盆栽试验,从黄土高原地区17个大豆品种上采集根瘤,对根瘤进行分离纯化、回接验证和遗传多样性分析,根据遗传多样性分析结果、分离宿主和分离地点,选出代表菌株用于筛选与黄土高原地区面积种植最大的大豆品种晋豆25相匹配的优良菌株,并在田间进行了根瘤菌喷施、拌种和种下接种不同接种方式效果比较试验。以瘤数、瘤干重、植株干重、植株全氮量为指标,通过蛭石盆栽试验初筛获得与晋豆25共生匹配效果好的根瘤菌10株;其进一步的耐旱试验和土壤盆栽复筛结果表明:菌株Bradyrhizobium liaoningense 4345和Sinorhizobium fredii 4338在结瘤能力、固氮能力、竞争能力和耐旱性能方面最好,揭示B.liaoningense 4345和S.fredii 4338具有良好应用前景。在田间进行的根瘤菌3种接种方式小区试验中,B.liaoningense 4345喷施处理在大豆植株干重、植株全氮量、占瘤率和产量等方面均显著高于另2个处理和对照,S.fredii 4338拌种和喷施较好,表明黄土高原地区大豆根瘤菌的适宜接种方式是喷施和拌种。

我国微生物肥料产业需求与技术创新

在国家绿色农业发展和乡村振兴计划等战略中,微生物肥料均被列为绿色新型投入品和优先支持发展的生物制品,必将在新时代迎来更好的发展机遇。本文在分析我国微生物肥料行业现状与标准体系特点基础上,阐述了微生物肥料具备的多功能、主动响应、信号调控、绿色环保等方面特征,提出了下一步发展的技术创新与新产品名录。

黄淮海地区优良大豆根瘤菌株的筛选与接种方式研究

采用蛭石盆栽和土壤盆栽试验,从黄淮海3省11个地区的22株大豆根瘤菌中筛选与大面积种植的大豆品种阜豆9765相匹配的优良菌株,并在田间进行了根瘤菌3种接种方式的效果比较试验。以根瘤菌结瘤数量、植株干重、植株全氮量和占瘤率为指标,通过蛭石盆栽试验初筛获得与阜豆9765共生匹配效果好的根瘤菌6株;进一步的土壤盆栽复筛结果表明:菌株Bradyrhizobium japonicum 4302和Sinorhizobium fredii 4822在结瘤能力、固氮能力和竞争能力方面强于其它4株根瘤菌,说明B.japonicum 4302和S.fredii 4822具有良好应用前景。在田间进行的根瘤菌拌种、喷施和种下接种的3种接种方式小区试验中,拌种处理在大豆植株干重、植株全氮量、占瘤率和产量等方面均显著高于另2个处理和对照,说明大豆根瘤菌的拌种方式更适用于黄淮海地区大豆种植。

慢生根瘤菌交叉结瘤及其系统发育关系的研究

选用包括 6株花生根瘤菌〔Bradyrhizobiumsp .(Arachis)〕在内的 13株慢生根瘤菌 ,进行了 6种豆科植物结瘤试验及其系统发育分析 .研究结果表明 ,慢生根瘤菌与试验的豆科宿主植物间普遍存在交叉结瘤 ,还发现有些菌株在原宿主外的豆科植物根部形成类根瘤的现象 .16SrDNA和 2 3SrDNA的PCR RFLP分析揭示出这些菌株rDNA基因的差异性 ,不同宿主来源的慢生根瘤菌株可以同属一个rDNA类型 ,而从同一宿主中分离的根瘤菌菌株可分属多种不同的rDNA类型 .研究结果表明 ,采用rDNAPCR RFLP等遗传背景分析的手段 ,可能筛选出广谱的根瘤菌菌株 .表 4参

我国蚕豆根瘤菌的多样性和系统发育研究

采用数值分类、16S rDNA PCR-RFLP、IGS PCR-RFLP等方法对分离自我国11个省的50株蚕豆根瘤菌及11株参比菌株进行了表型测定和遗传型研究,同时对5株蚕豆根瘤菌的代表菌株进行了16S rDNA全序列测定.表型测定的结果表明,在80%的相似水平上供试菌株分为4个群,各群间存在地区交叉;16S rDNA PCR-RFLP的聚类结果与数值分类的聚类结果有很好的一致性;IGSRFLP反映的多样性更明显,形成的遗传群较多,可用于菌株间的鉴别.实验结果表明我国蚕豆根瘤菌具有极大的表型多样性和遗传多样性.系统发育研究结果表明,蚕豆根瘤菌的代表菌株均位于快生根瘤菌属(Rhizobium)系统发育分支,与R.leguminosarum USDA2370的全序列相似性达99.9%,说明蚕豆根瘤菌属于Rhizobium,系豌豆根瘤菌的一个生物型.

光合细菌PCR检测技术的建立与应用

针对光合细菌传统的菌种鉴定方法和MPN定量方法存在费时、费力和准确性差的问题,本研究建立了光合细菌特异PCR鉴定技术和实时荧光PCR定量的检测技术.以微生物肥料产品常用的光合细菌沼泽红假单胞菌和类球红细菌作为研究对象,分别依据16SrDNA序列和gyrB序列设计出具有种水平特异性的引物,优化并确定了PCR反应条件,其灵敏度达到100pg/μL,对6个光合细菌产品鉴定的符合率为100%,结果表明建立的PCR鉴定技术具有特异性、灵敏性和实用性.再根据16SrDNA的保守序列设计了常用光合细菌通用引物,用其对系列稀释的已知菌含量样品的DNA模板进行荧光定量PCR,制作标准曲线.对10个光合细菌样品进行荧光定量PCR法测定,根据与标准曲线比较得出样品中的光合细菌含量,其结果与MPN法的相关系数为0.98,两者具有良好的相关性,结果表明建立的荧光定量PCR法可用于光合细菌的定量检测,并具有高特异性和快速等优点.

大豆根瘤菌与促生菌复合系筛选及机理研究

通过溶磷和生长素分泌的定性测定,从大豆根际土壤及实验室保藏菌株中分离筛选植物根际促生细菌(PG-PR),采用大豆根瘤菌和促生菌双接种的蛭石盆栽试验,初筛获得能够促进大豆植株生长、提高大豆根瘤菌结瘤固氮作用的促生菌5株。进一步的土壤盆栽复筛实验表明,筛选得到的5株促生菌与大豆根瘤菌进行双接种,能够在阜阳、济宁和延安的3种土壤中明显提高大豆的根瘤数量、根瘤干重、植株干重和全氮含量,并且能够促进植株对磷素的吸收。溶磷能力定量测定表明,5株促生菌均具有溶解无机磷的能力,有的菌株具有较高的溶磷能力;高效液相色谱法测定促生菌发酵液的成分,结果显示5株促生菌具有产生植物激素和有机酸的能力。经过16S rRNA基因序列分析,所分离的根际促生菌1-3,P7和P13分别属于芽孢杆菌属(Bacillussp.)、叶杆菌属(Phyllobacteriumsp.)和中华根瘤菌属(Sinorhizobiumsp.)。