CXCR7与肿瘤的生长和转移

CXCR7[chemokine(C-X-C motif)receptor 7]是一个近年来新发现的基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor1,SDF-1)的受体,由RDC1基因编码,通过与CXCL11及SDF-1结合发挥其生物学效应。CXCR7在多种肿瘤细胞表面高表达,在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要作用,促进肿瘤细胞的存活和生长、黏附与侵袭、肿瘤血管新生及癌细胞转移。与其他趋化因子受体不同,CXCR7在与SDF-1结合后,并不引起钙离子内流和趋化反应,而是通过建立合适的趋化因子的梯度,与CXCR4[chemokine(C-X-C motif)receptor 4]相互协调发挥作用。以CXCR7为靶点的肿瘤分子治疗研究不断增加,有望为肿瘤治疗提供新的方法。

CXCR7特异性拮抗剂SDF-1/54R的可溶性表达及活性评价

目的构建SDF-1/54R的原核可溶表达载体,并考查其对CXCR7的抑制作用。方法将PCR扩增的SDF-1/54r基因插入带有GST标签的可溶表达载体pET-41a+,并转化BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达的融合蛋白GST-SDF-1/54R通过SDS-PAGE和Western blotting进行检测,并利用GST亲和层析纯化。纯化产物经肠激酶酶切和纯化后得到目的蛋白SDF-1/54R。用SDF-1/54R处理CXCR7高表达的MCF-7细胞,利用MTT和趋化实验评价其对乳腺癌细胞增殖和转移的影响。结果利用新构建的可溶表达系统成功得到了目的蛋白SDF-1/54R,MTT和趋化实验证实SDF-1/54R对乳腺癌细胞MCF-7的增殖和转移具有明显的抑制作用。结论重组载体表达的可溶蛋白SDF-1/54R是一种良好的CXCR7特异性拮抗剂,具有开发成抗肿瘤药物的潜在应用价值。

CXCR4慢病毒表达载体的构建及细胞转染

目的:构建高表达CXCR4慢病毒并转染MCF-7细胞,获得高表达CXCR4的MCF-7细胞。方法:RT-PCR法扩增CXCR4基因,构建重组质粒CXCR4/p Sin-EF2,与ps PAX2、p MD2G质粒共转染HEK293T细胞包装慢病毒,以空载体包装的病毒为对照,将包装慢病毒感染人乳腺癌细胞MCF-7。RT-PCR和Western blot检测转染前后CXCR4基因和蛋白的表达,流式细胞术检测细胞表面CXCR4受体表达。结果:双酶切和测序结果证实重组质粒CXCR4/p Sin-EF2构建成功,转染HEK293T细胞获得高滴度慢病毒,RT-q PCR和Western blot证实病毒转染MCF-7细胞中CXCR4表达量显著增高(P<0.05),流式测得CXCR4阳性细胞由26.78%升到99.29%,而MCF-7Vector细胞膜表面CXCR4表达量与未转染病毒MCF-7细胞无明显差异。结论:成功构建CXCR4慢病毒表达载体,获得CXCR4受体稳定高表达的乳腺癌细胞。

川芎嗪抑制CEACAM1表达保护脂多糖诱导的心肌细胞损伤

目的探讨川芎嗪在脂多糖诱导的心肌细胞损伤中的作用及其机制。方法体外培养H9C2心肌细胞,以空白对照组(Sham)作为对照,予不同浓度(100~1 000 ng/m L)的脂多糖进行诱导,采用CCK8法检测心肌细胞损伤;给予不同浓度(20~80μmol/L)的川芎嗪进行干预,观察脂多糖刺激后心肌细胞损伤的变化;采用ELISA法检测培养液中白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)水平;荧光定量PCR检测心肌细胞中癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)、Caspase m RNA水平。结果与对照组相比,500 ng/m L的脂多糖导致心肌细胞存活率明显下降[(100.51±1.76)%vs(65.67±4.81)%,P<0.01],IL-1β[(25.17±1.77)pg/m L vs(60.50±3.67)pg/m L,P<0.01]和TNF-α[(34.33±2.48)pg/m L vs(64.67±2.49)pg/m L,P<0.01]的水平明显增加,TGF-β1水平下降[(69.00±3.07)pg/m L vs(39.50±1.87)pg/m L,P<0.01],心肌细胞中CEACAM1[(1.01±0.02)vs(1.30±0.03),P<0.01]、p-p38 MAPK[(1.01±0.02)vs(1.19±0.02),P<0.05]、Caspase3[(0.99±0.01)vs(1.25±0.03),P<0.05]的m RNA水平显著增加;给予40μmol/L的川芎嗪干预后,由脂多糖诱导的心肌细胞损伤程度减轻,细胞存活率增加[(65.67±4.80)%vs(81.17±2.42)%,P<0.05],IL-1β[(60.50±3.67)pg/m L vs(39.00±2.16)pg/m L,P<0.01]和TNF-α[(64.67±2.49)pg/m L vs(44.83±2.78)pg/m L,P<0.01]的水平降低,TGF-β1[(39.50±1.87)pg/m L vs(49.33±2.18)pg/m L,P<0.05]水平增加,CEACAM1[(1.30±0.03)vs(0.82±0.02),P<0.01]、p-p38 MAPK[(1.19±0.02)vs(0.98±0.03),P<0.05]、Caspase3[(1.25±0.04)vs(0.87±0.05),P<0.01]的m RNA水平显著减低。结论川芎嗪对脂多糖诱导的心肌细胞损伤有保护作用,该作用可能与脂多糖降低CEACAM1表达有关。

腺病毒载体构建小鼠趋化素基因缺陷性细胞系

背景:趋化素在动脉粥样硬化中的表达水平上调,趋化素可能参与了动脉粥样硬化的病理过程。目的:应用腺病毒介导的RNA干扰技术,构建并有效沉默趋化素基因的表达体,为研究其对动脉粥样硬化机制奠定实验技术基础。方法:以小鼠趋化素基因mRNA序列作为干扰靶点,以腺病毒基因pCD316-ZsGreen-shRNA作为质粒载体,设计4组靶向趋化素基因的shRNA序列,构建靶向鼠趋化素的shRNA表达质粒,另构建不针对任何已知mRNA的阴性对照shRNA表达质粒,筛选出干扰效果最好的shRNA,并在293T细胞对腺病毒进行包装和滴度测定。体外培养小鼠黑色素瘤细胞B16F10,转染腺病毒形成趋化素基因缺陷性B16F10细胞,用qPCR和Western blot检测感染腺病毒后细胞中趋化素mRNA和蛋白水平。结果与结论:(1)PCR以及基因测序结果表明Chemerin shRNA腺病毒载体构建成功,腺病毒的滴度为2×10^(10) PFU/mL,pCD-shRNA4对趋化素基因的抑制效果最显著(P<0.001);(3)qPCR和Western检测B16F10细胞中趋化素mRNA水平和蛋白水平,结果显示Chemerin-shRNA4达到一定的敲低效果;(2)表明腺病毒介导的shRNA-Chemerin4可有效沉默B16F10中趋化素基因的表达。