强直性脊柱炎髋关节韧带组织培养模型的建立及腺病毒转染的实验研究

背景:强直性脊柱炎(AS)是一种与炎症紧密相关但病因尚未完全阐明的慢性进行性结缔组织疾病。目的:本研究拟通过构建和比较AS韧带组织体外原位(in situ)、2D细胞贴壁体外(in vitro)及3D水凝胶体外培养模型,旨在探索更适合模拟AS韧带体外的培养模型。方法:AS髋关节韧带组织取自我科4例重度AS拟行髋关节置换的患者,平均年龄(44.0±4.1)岁。髋关节组织块常规消化获得单细胞,并行倒置相差显微镜观察和抗vimentin免疫荧光染色(IFC)鉴定检查。对上述髋关节韧带组织与成纤维细胞分别行组织块原位、体外2D贴壁和3D海藻酸盐水凝胶法培养,重组腺病毒(rAd)5-lacZ转染上述标本14 d后,分别采用大体观察、HE染色、Hoechst 33258实验、X-gal染色、抗β-gal免疫组织化学染色和酶联免疫吸附实验(ELISA)等对细胞形态与增殖能力、病毒转染效率和致炎性细胞因子表达等进行检测。结果:第2代AS髋关节韧带细胞抗vimentin IFC检测均出现明显的红色荧光,结果阳性,表明分离培养的细胞为成纤维细胞。rAd5-lacZ转染上述3种模型14 d后,倒置相差显微镜下观察HE染色后的细胞形态并计数单位面积下的细胞数、Hoechst 33258检测细胞DNA含量和ELISA法检测细胞分泌功能提示,3种模型中以2D平面的细胞增殖效率和致炎性细胞因子分泌能力最强(F=12.21、14.91、282.67、350.18,P<0.05或0.01)、但细胞"去分化"现象亦最明显,而AS韧带组织原位培养和成纤维细胞3D海藻酸盐水凝胶培养条件下的细胞增殖效率和致炎性细胞因子表达能力相似(t=1.37、0.71、1.44、1.83,P>0.05),细胞形态前后无明显变化。抗β-gal免疫组织化学染色并计数阳性细胞数/光镜下的总细胞数得出rAd-lacZ转染3种模型效率相似,分别为65.84%、72.26%和75.39%(F=0.873,P>0.05)。结论:韧带组织原位培养和成纤维细胞3D水凝胶培养能更好地模拟AS韧带成纤维细胞体内生存环境,且rAd5-lacZ能在一定时间内有效转染以上模型。本实验结果为建立有效的AS韧带体外培养及基因修饰模型提供实验基础。

解析与重塑软骨组织修复再生微环境

关节软骨是人体重要的组织,具有传导载荷、吸收震荡、润滑和抗磨损等特性,其对关节的活动和功能起着重要的作用[1]。但是,由于关节软骨是一种终末分化的结缔纤维组织,缺乏血液供应、淋巴循环以及神经支配,损伤后难以自身修复,为不可逆性和难治性运动伤病[2]。软骨损伤可直接影响患者的运动功能并可导致严重的骨关节炎等关节病变,对普通人的工作和生活造成损害,对运动员运动能力造成严重影响甚至导致其告别职业生涯[3]。

小分子药物BNTA通过上调Insig1缓解高胆固醇引起的骨关节炎

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是运动系统常见的退行性疾病,具有高发病率和高致残率。骨关节炎的发病机制目前尚不明确,既往研究认为骨关节炎发病主要与创伤因素相关,而近期研究表明,以胆固醇代谢异常为主的代谢性因素同样与骨关节炎密切相关,骨关节炎的治疗以早期对症治疗和晚期手术治疗为主,尚无针对病因的特效药物。既往研究中发现,有一种具有软骨保护作用的小分子药物BNTA,其在创伤引起的骨关节炎中具有较好的疗效,但其对高胆固醇引起的骨关节炎的作用尚不明确。本研究为探究BNTA对高胆固醇引起的骨关节炎的治疗作用及其机制,采用高胆固醇饮食构建了大鼠骨关节炎模型,取膝关节石蜡切片进行组织学评估,使用油红O染色评估大鼠软骨细胞内的脂质积聚情况,使用RT-qPCR、免疫荧光和免疫组化评估软骨细胞合成代谢、分解代谢及胆固醇代谢相关基因和蛋白质的表达。结果显示,BNTA可缓解高胆固醇大鼠骨关节炎模型中的病理表现,改善OARSI评分。在大鼠软骨细胞中,BNTA可促进合成代谢相关基因col2、sox9、acan的表达,抑制分解代谢相关基因mmp13、adamts5的表达,可改善高胆固醇引起的大鼠软骨细胞脂质积聚。在大鼠软骨细胞和高胆固醇大鼠骨关节炎模型中BNTA均可上调Insig1表达。本研究证实,高胆固醇可在体内和体外实验中加重骨关节炎,可引起大鼠软骨细胞脂质积聚增加。在体内和体外实验中BNTA均能缓解高胆固醇引起的骨关节炎表型,改善软骨细胞内的异常脂质积聚,其作用可能为通过上调Insig1抑制细胞内的胆固醇生物合成,从而缓解脂质异常积聚。

异体滑膜及青少年软骨颗粒移植修复兔半月板“白区”缺损及移植细胞的转归研究

目的:探讨异体滑膜和青少年软骨颗粒移植在半月板“白区”缺损修复上的协同作用;研究移植细胞的转归(存活和分化);研究滑膜间充质干细胞和软骨细胞间的相互作用。方法:选取2只未成年雄性兔作为滑膜及青少年软骨颗粒供体。选取24只成年雌性兔(共48个膝关节)制备半月板缺损模型,分为以下几组:空白组,半月板缺损无任何处理;单纯纤维蛋白胶组,在半月板缺损处填充单纯纤维蛋白胶;纤维蛋白胶+滑膜移植组,纤维蛋白胶包裹异体滑膜碎片填充到半月板缺损处;纤维蛋白胶+滑膜+异体青少年软骨颗粒移植组,纤维蛋白胶包裹异体滑膜和异体青少年软骨颗粒填充到半月板缺损处,每组样本量为12个膝关节。分别在术后8周和16周取材,通过组织学和免疫组织化学染色评估半月板缺损修复程度,针对雄性个体特有的Y染色体性别决定区基因(SRY)进行核酸原位杂交,并结合免疫荧光共定位评估移植细胞的存活和分化。其次,建立体外兔滑膜间充质干细胞和软骨细胞共培养系统,检测半月板纤维软骨细胞相关基因转录水平,并探索细胞间相互作用的可能机制。结果:在术后8、16周,相较于空白组、单纯纤维蛋白胶组及纤维蛋白胶+滑膜移植组,纤维蛋白胶+滑膜+异体青少年软骨颗粒移植组的缺损表现出良好的结构完整性、表面光滑度和边缘整合度,修复组织中可见较多的半月板样纤维软骨细胞,并且,细胞周围的基质在甲苯胺蓝和II型胶原免疫组织化学染色中表现为强阳性。在术后16周,纤维蛋白胶+滑膜移植组及纤维蛋白胶+滑膜+异体青少年软骨颗粒移植组的SRY核酸原位杂交信号表现为强阳性,表明移植细胞在受体中至少可存活16周。其次,核酸原位杂交和SOX9免疫荧光共定位显示表面移植滑膜组织中的细胞表现为SOX9阳性,表明移植滑膜组织中的细胞可分化为半月板纤维软骨细胞。滑膜间充质干细胞和软骨细胞共培养后半月板基质相关基因的转录水平与半月板纤维软骨细胞相似,并且,滑膜间充质干细胞和软骨细胞之间可通过细胞外囊泡相互作用。结论:异体滑膜和青少年软骨颗粒移植可协同促进半月板“白区”缺损修复;移植细胞在受体中至少可存活16周;移植滑膜组织中的细胞在半月板缺损处可分化为半月板纤维软骨细胞。

使用细胞外基质启发的天然水凝胶支架促进骨软骨修复与透明软骨形成

骨软骨缺损是一个巨大的挑战,目前临床上尚未确定满意的修复策略.尤其是不恰当的修复方法可能导致纤维软骨和软骨下骨的生成,从而导致骨软骨组织的退化,最终导致修复失败.本研究受天然细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中固有的化学成分的启发,提出了一种由天然多糖和多肽组成的新型仿生ECM支架,用于骨软骨修复.通过对天然生物聚合物进行修饰改性,形成具有可逆的客体-主体网络和刚性的共价网络的双网络结构,该支架不仅表现出优秀的生物相容性、细胞适应性和生物可降解性,还具有卓越的机械性能以适应骨软骨组织的环境.在兔的骨软骨缺损中,这种受ECM启发的支架不仅展示了强大的促进透明软骨形成的能力,还加速了具有优良骨密度的软骨下骨的再生.此外,新生的软骨和软骨下骨表现出了天然软骨的异质性特征,模拟了软骨到软骨下骨的渐进过渡.这些结果突显了该新型仿生ECM支架在临床应用中的潜在价值.

趋化素样因子1过表达促进强直性脊柱炎髋关节韧带成纤维细胞增殖和向成骨细胞转化的实验研究

目的探索趋化素样因子1（CKLF1）对AS髋关节韧带成纤维细胞增殖和向成骨细胞转化的影响。方法正常和AS髋关节韧带组织分别取自我科6例股骨颈骨折和4例重度AS拟行髋关节置换的患者。组织经常规消化得单细胞，并行倒置相差显微镜观察和抗波形蛋白（vimentin）免疫荧光染色（IFC）检测。对上述髋关节韧带组织及成纤维细胞分别行原位（in situ）和体外（in vitro）培养，重组腺相关病毒（rAAV）-lacZ、rAAV-hCKLF1转染21 d后收集标本。细胞增殖、致炎性细胞因子分泌、成骨关键靶基因、CKLF1及CCR4表达等分别采用ELISA、IFC和荧光定量反转录（RT）-PCR检测。各组间数据用单因素方差分析（LSD法），2组间比较采用t检验。结果第2代正常和AS细胞抗vimentin IFC检测均为阳性，表明分离培养的细胞为成纤维细胞。rAAV-hCKLF1转染21 d后，苏木精-伊红（HE）染色并计数单位面积下的细胞数、水溶性四氮唑法（WST-1）检测细胞增殖能力和Hoechst 33258检测细胞DNA含量均显示，CKLF1转染促进细胞增殖[与无病毒转染组、lacZ组相比，差异具有统计学意义（F=6.98，64.32，115.91；P〈0.05或P〈0.01）]；正常和AS髋关节韧带组织及成纤维细胞分泌的致炎性细胞因子（IL-6和TNF-α），均明显升高[与无病毒转染组、lacZ组相比，差异具有统计学意义（F=34.57，8.89；P〈0.05或P〈0.01）]；此外，与无病毒转染组、lacZ组及正常成纤维细胞的各组相比，CKLF1尚能促进AS成纤维细胞表达特异性骨细胞外基质蛋白[骨桥蛋白（OPN）和骨钙蛋白（OCN）]；荧光定量RT-PCR也得到了与上述检测结果相近的发现。结论过表达CKLF1促进成纤维细胞增殖和致炎性细胞因子分泌，增强成骨相关靶基因的转录，推测CKLF1可能在AS关节病理性骨化过程中发挥重要作用。