人脑微血管内皮细胞ACTG1基因真核表达载体的构建及表达

为了构建人脑微血管内皮细胞ACTG1基因的真核表达载体及在HEK293细胞中的表达,本研究采用RT-PCR方法,以单增李斯特菌侵染的人脑微血管内皮细胞提取的总RNA为模板,扩增ACTG1基因片段,TA克隆后经Sal I和Eco R I双酶切、测序等鉴定重组质粒,重组质粒再经双酶切,与真核表达载体p ACGFP连接,酶切鉴定后,Lipofactamine 2000转染HEK293细胞,荧光显微镜检测绿色荧光;同时采用Western-blotting对表达产物进行了鉴定。结果表明:PCR扩增得到1128 bp的ACTG1基因片段,ACTG1-p ACGFP真核表达载体构建成功,转染24 h后,在荧光显微镜下可见绿色荧光,Western-blotting检测分析,其分子量约为68 k Da的融合蛋白,与预期的大小相符合,表明重组蛋白表达成功,本研究为单增李斯特菌与脑微血管内皮细胞c DNA文库中相互作用蛋白的筛选和鉴定奠定了基础。

单核细胞增生性李斯特菌srtA基因的克隆与原核表达

为了探究从新疆发病绵羊中临床分离的单核细胞增多性李斯特菌(简称LM90SB2)srt A基因的特异性及其在原核表达质粒p ET32a中的表达,本研究利用PCR技术扩增LM90SB2的srt A基因,测序后并进行序列比对分析,将其克隆到原核表达质粒p ET32a中构成重组表达质粒p ET32a-srt A。重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导使其表达,SDS-PAGE电泳检测,同时采用Western-blotting对表达产物进行了鉴定。结果表明:Srt A蛋白在BL21(DE3)中大量表达,表达产物经SDS-PAGE电泳和Western-blotting检测分析其为1个分子量为47 ku的融合蛋白,与预期的大小相符合,成功的构建了重组质粒p ET32a-srt A,并使其在BL21(DE3)中获得了高效的表达。本研究为下一步研究其对李斯特菌致病性的影响及制备单克隆抗体奠定了基础。

不同动物来源肠球菌的分离·鉴定及耐药性研究

[目的]为动物肠球菌感染机制的研究提供理论依据。[方法]采用常规细菌分离方法从不同动物的肛拭样品中分离肠球菌,利用基于肠球菌保守tuf基因的PCR方法对其进行鉴定,同时采用KB纸片法对分离到的肠球菌进行药敏试验。[结果]共分离到177株细菌,经鉴定确定为肠球菌。药敏试验结果表明,鸡源肠球菌对青霉素的耐药率为80%,牛源肠球菌为46.4%;猪源肠球菌对环丙沙星的耐药率为27.3%,羊源肠球菌为2.8%;鸡源肠球菌对高浓度链霉素的耐药率为62.9%,而羊源未出现耐药菌株。[结论]来源于不同动物的正常菌群肠球菌对某些抗生素表现出不同程度的耐药性。

奶牛场主要病毒性繁殖障碍疫病感染情况调查

[目的]调查4个奶牛场主要病毒性繁殖障碍疫病的感染情况,为进一步进行病原学研究,揭示其致病作用,以及为制定防治措施奠定基础。[方法]选取4个规模化奶牛场,采集死胎、流产胎儿的肺、肝、脾、肾、淋巴结等组织,伴有肺炎症状犊牛的鼻拭子和耳组织,腹泻犊牛粪便,初乳以及冻精样品,共计248份。采用实时荧光RT-PCR/PCR检测方法,对牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)进行检测。[结果]发现BVDV、BPIV-3、IBRV的总阳性率分别为11.29%(28/248)、10.00%(18/180)、9.26%(15/162)。[结论]这4个奶牛场存在BVDV、BPIV-3、IBRV的感染,调查结果为规模化奶牛场繁殖障碍类主要病毒性疫病的防控提供了流行病学数据。

食源性单增李斯特菌LPXTG蛋白基因的检测

单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)作为四大重要食源性病原菌之一,对人类及多种畜禽健康威胁极大。LM细胞胞壁表面分布多种毒力蛋白,在感染机体过程中发挥重要作用,其中有一类至关重要的表面蛋白其C末端含有保守基序LPXTG,分选酶A能够识别基序LPXTG,共价结合到肽聚糖上,呈现在细胞表面发挥毒力作用。本试验以不同食品中分离得到的24株单增李斯特菌为试验对象,设计合成了41对预测含LPXTG基序表面蛋白的引物,利用PCR技术进行扩增,凝胶电泳成像系统检测扩增产物片段大小,计算24株食品源单增李斯特菌LPXTG基序表面蛋白的携带。结果表明,不同LM分离株LPXTG蛋白基因的携带率不同:其中仅有12.5%(3/24)的分离株携带率在85%以上;不同LPXTG蛋白基因的检出率不同,在41个检测对象中,有8个基因的检出率100%,有3个基因的检出率不足20%,Lmo1115基因在所有分离株中均未检测到。本研究对了解食品源LM分离株的LPXTG蛋白基因的分布以及探明食品源LM的致病性具有重要意义。

变溶菌素(Mutanolysin)酶解单核细胞增多性李斯特菌细胞壁条件的优化

为了最大效率提取单核细胞增多性李斯特菌LB90SB2细胞壁表面蛋白,本研究对变溶菌素浓度和酶解时间进行了优化。选择20、60μg/m L的变溶菌素浓度进行30 min-4 h,37℃酶解以及37和4℃低温联合酶解,通过测定酶解前后OD600和CFU,判断细胞膜完整性和计算原生质体形成率,筛选最佳酶解浓度和酶解时间。在最佳酶浓度的条件下,测定不同酶解时间细胞壁蛋白提取物浓度。结果表明:在酶解30 min-4 h,原生质体形成率从0提高至91.00%,细胞壁蛋白浓度从0.272增加至1.735 mg/m L。△OD600在1.86%-14.50%变动,但△OD600的统计学处理差异不显著。60μg/m L变溶菌素作用4 h的原生质体形成率达到91.00%,远高于20μg/m L变溶菌素作用4 h的78%。最终确定变溶菌素浓度为60μg/m L,酶解时间4 h为酶解LM90SB2细胞壁的最佳条件。本研究为下一步研究细胞壁表面蛋白奠定基础。

长链非编码RNA Gm35082-202对布鲁氏菌引起的细胞焦亡的影响

【目的】研究长链非编码RNA(lncRNA)Gm35082-202对布鲁氏菌侵染引起的细胞焦亡的影响,旨在为研究lncRNA参与布鲁氏菌引起的先天性免疫反应提供参考。【方法】在Ensemble数据库中查找并分析Gm35082-202在染色体上的位置、外显子等信息;采用RNAfold在线软件预测Gm35082-202的二级结构;通过KEGG、GO富集分析预测Gm35082-202功能;用牛种布鲁氏菌(S2308)以感染复数(MOI)为0.01侵染小鼠巨噬细胞(RAW264.7),在侵染不同时间点(0、4、8、12、24、36、48 h)收集细胞,用实时荧光定量PCR检测Gm35082-202的表达量;利用LncLocator网站预测Gm35082-202亚细胞定位,用实时荧光定量PCR检测Gm35082-202在细胞质、细胞核的表达;将3条Gm35082-202 siRNAs (siRNA1、siRNA2和siRNA3)、siRNA NC转染RAW264.7细胞,实时荧光定量PCR检测Gm35082-202的表达量,筛选干扰效率最高的siRNA进行后续试验。Gm35082-202-siRNA、Gm35082-202-siRNA-NC转染RAW264.7细胞24 h后,再用布鲁氏菌侵染,以PBS为空白对照组(PBS),只用布鲁氏菌侵染的细胞为侵染对照组(Bru)。侵染24 h后收集PBS组、Bru组、Gm35082-202-siRNA组(Bru-siRNA)、Gm35082-202-siRNA-NC组(Bru-NC)细胞,用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测各组细胞中NOD样受体蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、Caspase-11、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-18的相对表达量,用ELISA法检测各组上清液中细胞因子IL-1β、IL-18分泌水平;通过菌落计数,比较各组布鲁氏菌的胞内生存能力。【结果】基因结构分析表明,Gm35082-202是大小为525 nt的lncRNA(Trianscript ID:ENSMUST00000208164.2),含有2个外显子,位于小鼠7号染色体(Chr7:100 324 295~100 326 967),其二级结构含有多个茎环及多分枝内部环结构;KEGG信号通路富集分析表明,Gm35082-202主要参与NOD样受体、钙调节以及细胞因子信号通路的调控;GO功能分析结果显示,Gm35082-202功能主要涉及DNA转录、线粒体组分以及金属离子结合。布鲁氏菌侵染RAW264.7细胞后,与0 h组相比,侵染4和8 h时Gm35082-202表达量显著增加(P<0.05),侵染12、24、36和48 h时表达量极显著增加(P<0.01);亚细胞定位预测结果表明,Gm35082-202主要分布于细胞核(58.3%),其次是细胞质(35.1%),布鲁氏菌侵染RAW264.7细胞0 h时,Gm35082-202在细胞核中分布比例为63.4%,在侵染4、24和36 h Gm35082-202在细胞核中的分布减少,分别为24.5%、29.6%和30.4%。Gm35082-202-siRNA1、Gm35082-202-siRNA3均极显著降低Gm35082-202的表达量(P<0.01),Gm35082-202-siRNA1干扰效率最高。与Bru组相比,Bru-siRNA组中NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、IL-1β和IL-18基因的表达量均极显著降低(P<0.01),NLRP3和Caspase-11蛋白的表达量显著降低(P<0.05),Caspase-1蛋白的表达量极显著降低(P<0.01);细胞上清中IL-1β和IL-18分泌水平均极显著下降(P<0.01);Bru-siRNA组胞内布鲁氏菌数显著升高(P<0.01)。【结论】布鲁氏菌通过上调Gm35082-202表达促进巨噬细胞焦亡,该结果可为进一步探究布鲁氏菌侵染时Gm35082-202参与调控宿主细胞焦亡的分子机制提供参考。