心力衰竭相关新基因的筛选和分析

目的分析心力衰竭潜在的相关基因以及相关机制。方法从基因表达综合数据库中下载数据集GSE18703,使用R软件中“limma”包分析差异表达基因(DEGs)。对DEGs进行基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,以探索心力衰竭相关的生物学功能和信号通路。使用Cytoscape软件构建蛋白质相互作用(PPI)网络,识别心力衰竭发病机制相关的关键基因,用荧光定量聚合酶链反应(qPCR)法对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的大鼠H9C2心肌细胞模型进行转录水平的验证。通过h TFtarget数据库分析关键基因的转录因子网络,以探究心力衰竭的发生机制。结果共筛选出292个DEGs,其中上调基因140个,下调基因152个。GO分析显示,DEGs主要富集于细胞外区、细胞外空间、血液微粒等细胞成分以及嗅觉转导、血管平滑肌收缩、代谢途径等通路。KEGG通路分析发现,DEGs主要富集于环磷酸鸟苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)信号通路、肥厚型心肌病和扩张型心肌病等信号通路。通过PPI网络,筛选出6个关键基因,分别是Gprc6a、C3、Anxa1、Oxt、Gpr4和Avpr1b,并发现有528个转录因子对这6个关键基因进行转录调节。qPCR结果显示,心力衰竭情况下Anxa1和Gpr4的mRNA表达差异有统计学意义,进一步验证了以上筛选结果。结论通过生物信息学分析方法发现了6个与心力衰竭相关的关键基因,有助于更好地了解心力衰竭的发生机制和探索新的治疗靶点。

miR-20a调控压力超负荷型心肌肥大

背景:心肌肥大是心脏对压力超负荷等生理和病理刺激所做出的适应性反应,早期具有代偿意义,若刺激持续进行可引起心肌病变导致心力衰竭。micro RNAs参与调控了心肌肥大的发生发展,然而mi R-20a在压力超负荷所致心肌肥大中的作用尚未见报道。目的:探究mi R-20a在压力超负荷所致心肌肥大中的作用及其机制。方法:横向主动脉缩窄术诱导心肌肥大小鼠模型,使用血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大H9c2细胞模型。体内实验在小鼠心脏原位注射mi R-20a过表达腺病毒,体外实验将mi R-20a mimic转染至H9c2细胞。通过检测心质量/体质量比值、细胞表面积、心肌纤维化等指标评估心肌肥大,实时荧光定量PCR法检测心房利钠肽、脑利钠肽、β-肌球蛋白重链和mi R-20a的表达水平,Mito Tracker法检测线粒体分裂情况,RNAhybrid软件预测miR-20a的下游靶基因。结果与结论:(1)在心肌肥大细胞模型和动物模型中,mi R-20a的表达水平均显著降低(P<0.05);(2)在动物水平,过表达miR-20a显著抑制了横向主动脉缩窄手术诱导的心肌肥大,包括抑制了肥大标志基因表达水平的升高(P<0.05),抑制了心脏体积的增大,抑制了心质量/体质量比值的升高(P<0.01),抑制了心肌横截面积的增大(P<0.05)以及减轻了心肌纤维化程度(P<0.01);(3)在细胞水平,过表达mi R-20a显著抑制了血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大,包括抑制了心房利钠肽(P<0.05)、脑钠肽(P<0.01)、β-肌球蛋白重链(P<0.05)等肥大标志基因表达水平的升高,抑制了蛋白质/DNA比值的升高(P<0.01),抑制了细胞表面积的增大(P<0.05);(4)过表达mi R-20a显著抑制了血管紧张素Ⅱ诱导的线粒体分裂(P<0.05);(5)RNAhybrid软件分析结果显示mi R-20a与蛋白质活化酶抑制剂αm RNA的3’非翻译区可以很好地互补配对,且预测的结合位点具有高度保守性;(6)结果表明,在压力超负荷心肌肥大模型中mi R-20a表达水平显著下调,过表达mi R-20a可在细胞水平和动物水平抑制心肌肥大表型,并减轻血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞线粒体分裂。

钙结合蛋白S100A11促进结直肠癌进展的作用及其机制研究

目的:探讨钙结合蛋白S100A11调控结直肠癌(colorectal cancer,CRC)进展的作用及其机制。方法:利用GEPIA、UALCAN和HPA等数据库分析S100A11在CRC中的表达情况及其与CRC临床分期和预后的关系,并利用CRC细胞系/永生化肠上皮细胞进行验证,利用RNA干扰实验进一步分析S100A11对CRC细胞迁移及CRC生物学通路的影响。结果:数据库分析结果显示,与正常结直肠组织相比,S100A11在CRC组织中表达显著升高,并且S100A11与CRC的晚期分期及不良预后密切相关。RT-qPCR和Western blot结果也显示,S100A11在CRC细胞中表达升高。敲低S100A11能够有效抑制SW480细胞的迁移和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程。沉默CRC细胞中S100A11的表达后,利用转录组测序和生信分析,共筛选出149个差异表达基因,这些差异表达基因的功能网络富集结果主要涉及到炎症性肠病、黏着斑和PI3K-Akt信号通路等。结论:本研究发现高表达的S100A11是CRC转移的重要因素,并初步揭示S100A11调控CRC细胞的关键信号通路,为深入探讨S100A11调控CRC进展的分子机制提供了实验依据。

Csn-B联合伊马替尼通过Nur77/Pim-1/Drp1信号通路对慢性髓系白血病细胞凋亡的影响

目的:探讨Nur77特异性激动剂Csn-B联合伊马替尼通过促进Nur77的表达发挥抗慢性髓系白血病细胞活性,并探讨其信号通路的潜在作用。方法:首先应用CCK-8、Transwell法分别检测单独Csn-B、伊马替尼以及两者联合对K562细胞增殖迁移的抑制作用;进一步通过流式细胞术分别检测Csn-B、伊马替尼以及两者联合处理K562细胞的凋亡率,Western blot检测K562细胞中凋亡相关蛋白Nur77、Pim-1、Drp1、p-Drp1 S616、Bcl-2和Bax的表达水平变化;最后再分别检测Csn-B、伊马替尼以及两者联合处理K562细胞活性氧的表达水平。结果:在GSE43754数据集中慢性髓系白血病患者Nur77水平较正常人群显著下降(P<0.001)。Csn-B联合伊马替尼可以显著抑制K562细胞的增殖和迁移(均P<0.001),诱导K562细胞凋亡(P<0.001)。Csn-B可以促进K562细胞中Nur77的表达,且与伊马替尼联合应用后可起到协同作用,增强伊马替尼的敏感性。Csn-B与伊马替尼联合处理较单药处理更能显著增强K562细胞内及线粒体内的ROS水平(均P<0.001)。结论:Csn-B联合伊马替尼可通过Nur77/Pim-1/Drp1通路增强细胞活性氧的表达,诱导K562细胞凋亡。

非诺多泮抑制小鼠胸主动脉瘤的实验研究

目的探讨多巴胺一型受体激动剂非诺多泮(FNDP)是否对小鼠胸主动脉瘤(TAA)具有保护作用。方法对3周龄的雄性C57BL/6J小鼠采用β-氨基丙腈(BAPN)复制TAA模型。25只小鼠分为三组:对照组、BAPN组、BAPN+FNDP组(腹腔注射FNDP)。统计TAA的发生率和生存率,观察胸主动脉的大体变化,弹力蛋白(Elastin)染色观察形态学改变。免疫组化法检测基质金属酶2(MMP2)、基质金属酶9(MMP9)和白细胞分化抗原68(CD68)的变化。明胶酶谱法检测MMP2和MMP9的活性。反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测多巴胺受体1(D1DR)、多巴胺受体2(D2DR)、多巴胺受体3(D3DR)、多巴胺受体5(D5DR)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及平滑肌蛋白22α(SM22α)的mRNA表达情况。结果与对照组相比,BAPN组有明显的TAA形成,胸主动脉壁弹力纤维紊乱与断裂,且D1DR和D5DR的mRNA水平均显著下降。与BAPN组相比,BAPN+FNDP组小鼠TAA的形成率和动脉瘤破裂率明显降低;胸主动脉壁的弹力纤维紊乱与断裂明显改善;胸主动脉壁内MMP2和MMP9的表达水平均显著下降,血清中MMP2的酶活性显著降低;胸主动脉壁中巨噬细胞浸润显著降低,且IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的mRNA水平均显著下降;α-SMA和SM22αmRNA表达水平无显著差异。结论FNDP可抑制小鼠TAA的进展,有可能成为治疗TAA的一个潜在药物。

急性心肌缺血时心室易颤期的变化趋势

对心室易颤性(或易损性)的研究是缺血性心脏病研究中的一个重要方面。在以前的研究中,多以室颤阈(VFT)作为心室易颤性的标志,而很少通过观察易颤期(VP)的变化来了解心室的的易颤性。近年来不少资料表明。

大鼠基底动脉和肾动脉肾上腺素受体的异质性

用离体小血管收缩功能实验法比较了Ｗｉｓｔａｒ大鼠基底动脉（ＢＡ）和肾动脉（ＲＡ）β和α（α_１和α_２）肾上腺素受体分布和功能的差异。结果表明：（１）由β受体介导的非内皮依赖性舒张反应在ＢＡ明显强于ＲＡ，提示ＢＡ的β受体分布多于ＲＡ。（２）大多数ＢＡ对α_１激动剂无反应，仅个别ＢＡ对α_１激动剂显示一种低亲和力、低效能的收缩反应，这与ＲＡ明显不同。提示大多数ＢＡ无α_１受体分布，仅个别ＢＡ有α１受体分布，但其亚型可能不同于ＲＡ上的α_１受体亚型。（３）无论是保留内皮还是去除内皮，ＢＡ对α_２受体激动剂ＢＨＴ９２０（１０￣（－５）ｍｏｌ／Ｌ）均无反应，而在ＲＡ保留内皮对ＢＨＴ９２０（１０￣（－５）ｍｏｌ／Ｌ）呈舒张反应，去内皮后则呈收缩反应。提示在大鼠ＢＡα２受体分布极少，而在ＲＡ则有α_２受体分布，且内皮之α_２受体介导内皮依赖性舒张反应，平滑肌之α_２受体介导内皮非依赖性收缩反应。

镁对急性缺血及再灌注心肌易损期延长的拮抗作用

本实验发现，兔心急性缺血及再灌注早期心室肌易损期（ＶＰ）均明显延长，并伴有自发性心律失常发生率增高。静脉滴注硫酸镁可使这种延长的ＶＰ明显缩短甚或＂消失＂，并使自发性心律失常发生率降低。提示硫酸镁可通过缩短ＶＰ这一途径降低心肌的易损性。

去甲肾上腺素转运体与心血管疾病

去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）是一种经典神经递质，由某些中枢神经元及外周的交感神经末梢释放。在中枢，NE作为重要的神经递质，作用于不同的脑区，调控觉醒、应激反应、情绪和认知功能等高级神经活动。在外周心血管系统中，交感神经末梢释放的NE影响心率、心电活动、心肌收缩力及血管张力，从而完成对心脏活动及血压的调节。

大鼠基底动脉、肺动脉和尾动脉血管紧张素Ⅱ受体亚型比较

用离休血管收缩功能实验法分析了大鼠基底动脉（ＢＡ）、肺动脉（ＰＡ）和尾动脉（ＣＡ）血管紧张素Ⅱ（ＡⅡ）受体ＡＴ１和ＡＴ２亚型的组成及各自的功能意义。结果表明，ＢＡ对ＡⅡ无收缩反应，提示在ＢＡ可能不表达ＡＴ１亚型，或表达极微。在ＢＡ有ＡＴ２亚型分布，通过内皮－ＮＯ－ｃＧＭＰ途径（而不是环氧合酶依赖性途径）介导ＢＡ对ＡⅡ的内皮依赖性舒张反应。在ＰＡ和ＣＡ均存在着ＡＴ１亚型，介导ＰＡ和ＣＡ对ＡⅡ的收缩反应。但ＰＡ的ＡＴ１亚型具有亲和力高、易脱敏的特点，提示该ＡＴ２亚型可能不同于存在于ＣＡ的ＡＴ１亚型。

大鼠基底动脉和肾动脉血管加压素受体及钙动员特性的比较

用离体小血管分析了大鼠基底动脉（ＢＡ）和肾动脉（ＲＡ）血管内皮及平滑肌上血管加压素受体亚型的分布，及与之耦联的平滑肌细胞钙动员之特征。结果表明，精氨酸血管加压素（ＡＶＰ）对内皮完整和去内皮之ＢＡ和ＲＡ均有强烈的收缩作用，后者可被Ｖ＿１受体选择性拮抗剂ｄ（ＣＨ＿２）＿５Ｔｙｒ（Ｍｅ）ＡＶＰ所拮抗。未观察到ＡＶＰ对ＢＡ和ＲＡ的内皮依赖性舒张作用。提示在ＢＡ和ＲＡ之平滑肌细胞上均有Ｖ＿１受体分布，介导ＡＶＰ的直接缩血管作用，这在ＡＶＰ对ＢＡ和ＲＡ的作用中占主导地位。在Ｖ＿１受体所耦联的平滑肌细胞钙动员方面，ＢＡ和ＲＡ有所不同：ＢＡ的ＡＶＰ敏感钙池明显小于ＲＡ，ＢＡ的收缩对胞外钙内流的依赖性较之ＲＡ大。硝苯吡啶不仅抑制ＡＶＰ诱发的Ｃａ￣（２＋）内流，而且可明显抑制胞内钙池的释放。ＢＡ对硝苯吡啶比ＲＡ敏感。蛋白激酶Ｃ参与了ＡＶＰ对ＢＡ和ＲＡ的钙动员和收缩作用。

心力衰竭实验研究进展

有关心衰的知识在快速增长 ,这种情况改变了人们对心衰的传统概念。人们逐渐认识到 ,心衰的病理生理学变化极其复杂 ,不仅包括神经 体液因素的代偿性变化 ,还涉及到心肌结构性变化、钙稳态的紊乱、受体密度的改变以及细胞信息传递的变化等。本文简述了心衰病理生理学研究的新进展 ,常用的心衰动物模型 ,心衰的实验性诊断指标 。

大鼠血管平滑肌胞内钙池及其与血管反应性的关系

以在无钙介质条件下激动剂引起的血管收缩作为胞内钙池释放指标，分析大鼠不同血管平滑肌胞内钙池容量的差异，不同激动剂敏感钙池间及其与咖啡因敏感钙池间的相互关系，以及钙池的差异与血管反应性的可能关系。结果表明：（１）不同血管平滑肌胞内钙池容量明显不同，富含平滑肌脏器动脉钙池较大血管钙池大；（２）不同激动剂敏感钙池并不完全利用同一钙池，即当一种激动剂敏感钙池被耗竭后，另一种激动剂仍能引起少量钙释放；（３）所试血管均不存在除极化诱发的钙释放，但均存在咖啡因敏感钙池，后者与激动剂敏感钙池并非完全是同一钙池；（４）钙池大小与单位湿重血管平滑肌的最大收缩张力呈正相关（ｒ＝０．９５６７），提示钙池容量与血管平滑肌收缩力可能有一定关系。

卒中易感型自发性高血压大鼠血管平滑肌收缩装置对Ca2＋敏感性变化的研究

目的比较卒中易感型自发性高血压大鼠（ＳＨＲｓｐ）与常压（Ｗｉｓｔａｒ）大鼠基底动脉（ＢＡ）和尾动脉（ＣＡ）平滑肌收缩装置对Ｃａ２＋敏感性（以ｐＣａ５０表示）的差异。方法采用血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）膜化学高通透技术并结合细胞钙钳制技术，使上述血管肌条（环）平滑肌细胞膜具有高通透性，并使胞内Ｃａ２＋固定于一定水平，然后制作神经鞘氨醇（ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）预温浴后的肌条（环）ｐＣａ－张力曲线，比较ＳＨＲｓｐ和Ｗｉｓｔａｒ大鼠ＢＡ和ＣＡ平滑肌在不同处理时的ｐＣａ５０值。结果不论ＳＨＲｓｐ或Ｗｉｓ－ｔａｒ大鼠，ＢＡ平滑肌收缩装置对Ｃａ２＋的敏感性均高于ＣＡ（Ｐ＜０．００５）。ＳＨＰｓｐ的ＢＡ和ＣＡ平滑肌收缩装置对Ｃａ２＋的敏感性均高于Ｗｉｓｔａｒ大鼠的相应血管（Ｐ＜０．００５）。蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）抑制剂Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ可使ＳＨＲｓｐＣＡ平滑肌ｐＣａ－张力曲线右移，但不能使ＳＨＲｓｐＣＡ平滑肌ｐＣａ－张力曲线右移，甚至轻微左移。结论ＳＨＲｓｐＢＡ和ＣＡ平滑肌收缩装置对Ｃａ２＋的敏感性均高于Ｗｉｓｔａｒ大鼠。

血管对激动剂脱敏的机制分析

用离体血管收缩功能实验法观察了大鼠数种动脉对不同激动剂的脱敏特征，并对脱敏的机制进行了初步分析。结果显示：（１）血管对肽类激动剂（ＡⅡ、ＡＶＰ）极易脱敏，而对儿茶酚胺类激动剂（ＮＥ、ＰＥ）不易脱敏；（２）在短时间（３０ｍｉｎ）内，血管对肽类和儿茶酚胺类激动剂表现为同类脱敏；（３）内皮－ＥＤＲＦ－ｃＧＭＰ通路不参与脱敏，提示脱敏主要是平滑肌的功能变化；（４）用ｐｈｅｎｙｌａｒｓｉｎｅｏｘｉｄｅ（ＰＡＯ，１０￣（－５）ｍｍｏｌ／Ｌ）抑制膜受体的胞内化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）可短暂阻抑脱敏的发展但不能长时阻抑脱敏，用ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ（ＣＱ，１０￣（－５）ｍｏｌ／Ｌ）抑制胞内受体向细胞膜的“再插入”（ｒｅｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）可明显加快脱敏，但这种作用在不同血管有较大差异，表明膜受体循环参与脱敏，但不是脱敏的唯一机制；（５）在同类脱敏时，两类平滑肌（ｐｈａｓｉｃａｎｄｔｏｎｉｃ）细胞膜电压依赖性钙通道（ＶＤＣ）的功能未受到抑制；（６）脱敏后ＧＴＰ＿γＳ的量－效曲线下移，最大反应降低，表明脱敏时Ｇ蛋白发生了变化；（７）ＳＨＲ血管平滑肌对上述肽类和儿茶酚胺类激动剂的脱敏并未减弱。

大鼠基底动脉和尾动脉平滑肌G蛋白的异质性

用离体血管收缩功能实验法分析了大鼠基底动脉（ＢＡ）和尾动脉（ＣＡ）平滑肌细胞Ｇ蛋白的异质性。结果显示，当ＢＡ和ＣＡ平滑肌被精氨酸血管加压素（ＡＶＰ）激动后，该两种血管对Ｇ蛋白非选择性激活剂ＧＴＰγＳ的收缩反应发生了相反的变化：ＢＡ对ＧＴＰγＳ的收缩增强，并且这种收缩增强不受百日咳毒素（ＰＴ，Ｇｉ和Ｇｏ抑制剂）的影响。而霍乱毒素（ＣＴ，Ｇｓ激活剂）则完全抑制这种收缩，呈单相反应。与ＢＡ相反，ＣＡ对ＧＴＰγＳ的收缩减弱，后者可被ＰＴ预温育反转为收缩增强，而且ＣＴ对这种收缩的抑制作用短暂，呈双相反应。结果提示，ＢＡ和ＣＡ平滑肌细胞介导激动剂收缩反应的Ｇ蚕白存在异质性。

平滑肌细胞钙钳制技术

用金黄色葡萄球菌α毒素（α－ｔｏｘｉｎ）或β溶血皂素（β－ｅｓｃｉｎ）处理平滑肌小肌条，可将细胞膜穿通许多小孔，使膜对某些离子及物质的屏障作用消失，但不影响受体－Ｇ蛋白－第二信使系统的耦联。根据ｃａ￣（２＋）ＥＧＴＡ的平衡结合常数Ｋ进行计算，将高浓度（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）ＥＧＴＡ和具一定Ｃａ￣（２＋）浓度的溶液按一定比例混合，可获得所需Ｃａ￣（２＋）浓度的缓冲溶液。后者通过膜小孔进入细胞内可将胞浆游离Ｃａ￣（２＋）浓度“钳制”（ｃｌａｍｐ）在某一要求的水平上。在该模型上可方便地观察一些不依赖胞浆游离Ｇａ￣（２＋）浓度变化的细胞活动过程。该法最适宜于研究激动剂对平滑肌的钙增敏作用及其机制。如适当良，亦可用于心肌、骨骼肌及其它细胞，对研究细胞内信号传导、药物作用机理等方面，有独到的优点。

中国协和医科大学生理学实验教学改革实践体会

中国协和医科大学生理学系在历史上因其出色的教学和科研而久负盛名,其中生理学实验教学功不可没。近二十年来,随着科学的发展,对生理学实验教学提出了更高的要求,学生已不满足于验证已有的理论,而更把生理学实验视为体验科学发现过程、培养科学思维和整体观念、掌握科学研究手段的重要一环。为此,协和生理学系率先进行了探索性改革。本文总结了该学系自上世纪80年代以来在生理学实验教学方面的探索性改革经验、教训和体会,希望能起到抛砖引玉的作用,以提高我国生理学教学水平。

成人心房肌细胞的急性分离和电生理学鉴定

目的介绍一种适用于成人的心房肌细胞膜片钳研究的急性分离方法,并对所分离的细胞进行电生理学鉴定。方法采用两步酶解与机械分离相结合的方法制备成年人心房肌细胞标本,应用倒置显微镜初步观察细胞形态、数目后,用全细胞膜片钳技术鉴定细胞的电生理学特性。结果分离的细胞呈多种形态,其中有良好折光性、细胞膜完整、有清晰横纹的杆状细胞约占50%-60%,计算出11例独立实验分离出的此类细胞获得率为(57.2±3.1)%;具有正常的电生理学特性,能够诱发出人心房肌细胞上主要的Na+、K+通道混合电流以及心房肌细胞特有的超快速激活钾通道电流(IKur)。结论实验数据表明该方法分离的细胞保持有其典型的通道特性,并证明其具有实用、快速和高效的特点,适用于人心房肌细胞的电生理学和电药理学研究,有良好的可行性。