难治性肾病综合征患儿他克莫司个体化治疗的药学进展

自20世纪50年代以来,口服糖皮质激素已成为治疗儿童肾病综合征(Nephrotic syndrome,NS)的主要方法,大多数患者在口服泼尼松4周内有反应,然而,60-80%的患者会出现复发,并发展为频繁复发或激素依赖,还有10%-15%的患儿对皮质类固醇无反应或随后出现激素耐药。难治性肾病综合征(Refractory nephrotic syndrome,RNS)是原发性肾病综合征中频复发型NS(Frequently relapse nephroticsyndrome,FRNS)、激素依赖型NS(steroid-dependent NS,SDNS)和激素抵抗型NS(steroid-resistant NS,SRNS)病例的总称。糖皮质激素是治疗NS的基石,大多数首次出现NS的儿童通过皮质类固醇治疗获得缓解。在治疗对糖皮质激素出现初始耐药或延迟耐药的儿童时,可使用免疫抑制剂包括钙调神经磷酸酶抑制剂(calcineurin inhibitor,CNI)和非免疫抑制剂如血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)或血管紧张素受体阻滞剂(ARB)。常用的CNI包括他克莫司和环孢素,其中他克莫司由于有神经毒性、肾毒性、高血压、糖耐量减低等不良反应,且部分不良反应呈现剂量相关性,因此进行血药浓度监测和相关基因检测非常必要。

PI3K/Akt通路在肝癌细胞迁移和侵袭中的作用

目的探讨PI3K/Akt信号通路中3-磷酸肌醇-依赖性激酶1(PDK1)、10号染色体上的磷酸酶和张力蛋白同源蛋白(PTEN)、蛋白激酶B(Akt)表达对肝癌细胞迁移和侵袭的作用。方法常规培养肝癌SMMC-7721细胞,将细胞分为对照组、PDK1抑制剂组、Akt激动剂组、PTEN抑制剂组。对照组加入RPMI-1640培养基,PDK1抑制剂组加入PDK1的特异性抑制剂OSU03012,Akt激动剂组加入Akt特异性激动剂SC79,PTEN抑制剂组加入PTEN特异性抑制剂VO-Ohpic。采用细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力,Transwell小室检测细胞侵袭能力,Western blotting法检测PDK1基因相关蛋白PDK1、p-PDK1、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)及PTEN、Akt蛋白表达。结果与对照组比较,PDK1抑制剂组细胞迁移率减少,Akt激动剂组和PTEN抑制剂组细胞迁移率增加(P<0.05或<0.01)。与对照组比较,PDK1抑制剂组穿膜细胞数减少,Akt激动剂组和PTEN抑制剂组穿膜细胞数增加(P均<0.01)。与对照组比较,PDK1抑制剂组PDK1、p-PDK1表达降低,E-cadherin表达升高,Vimentin表达降低;Akt激动剂组Akt表达升高,PTEN表达降低;PTEN抑制剂组PTEN表达降低,Akt表达升高(P<0.05或<0.01)。结论抑制PI3K/Akt信号通路中PDK1表达可以抑制肝癌细胞迁移和侵袭,促进Akt和抑制PTEN表达可以促进肝癌细胞迁移和侵袭。

Mmp-2重组真核表达载体的构建及MMP-2蛋白对肝癌细胞的作用机制探讨

目的:构建人基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)基因重组真核表达载体,探讨MMP-2蛋白对肝癌细胞迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法:以肝癌SMMC-7721细胞为研究模型,以基因重组技术构建pEYFP-Mmp-2重组真核表达载体,p EYFP-Mmp-2一过性转染模型细胞过表达MMP-2-YFP,siRNA转染沉默模型细胞内源性MMP-2表达,设立空白对照、MMP-2沉默对照组、MMP-2沉默组、过表达MMP-2融合蛋白对照组、过表达MMP-2融合蛋白组,划痕实验检测细胞迁移能力,侵袭小室实验检测细胞侵袭能力,钙蛋白酶(calcium-activated neutral protease,Calpain)特异性抑制剂Calpeptin抑制Calpain活性,蛋白印记实验检测MMP-2、MMP-2-YFP、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达变化。结果:成功构建人Mmp-2重组真核表达载体pEYFP-Mmp-2。pEYFP-Mmp-2转染过表达MMP-2融合蛋白组细胞高表达MMP-2-YFP。与MMP-2沉默对照组相比,MMP-2沉默组内源性MMP-2表达明显下调(P=0.000),细胞12 h、24 h及48 h迁移率明显降低(P=0.000或P=0.001),48 h侵袭率明显降低(P=0.004),E-cadherin表达明显上调,N-cadherin及Vimentin表达明显下调(P=0.000)。与过表达MMP-2融合蛋白对照组相比,过表达MMP-2融合蛋白组12 h、24 h及48 h迁移率明显增强(P=0.015或P=0.001),48 h侵袭率明显升高(P=0.011),细胞E-cadherin表达明显下调,N-cadherin及Vimentin表达明显上调(P=0.003或P=0.001)。Calpeptin预处理明显降低过表达MMP-2融合蛋白组细胞迁移率和侵袭率(P=0.000),上调E-cadherin,下调N-cadherin及Vimentin蛋白表达水平(P=0.000)。结论:本实验通过基因重组技术成功构建人Mmp-2重组真核表达载体pEYFP-Mmp-2,成功表达MMP-2-YFP融合蛋白;并发现MMP-2通过调节Calpain介导肝癌SMMC-7721细胞迁移、侵袭及EMT。

人TIMP-2蛋白在肝癌细胞迁移与侵袭中的作用

目的通过原核表达获取人TIMP-2蛋白,探讨TIMP-2在肝癌细胞迁移及侵袭中的作用。方法以SM M C-7721肝癌细胞总RNA为模板,用RT-PCR技术扩增出人TIM P-2基因c DNA,通过基因重组技术构建原核表达载体p GEX-TIMP-2并在大肠杆菌Origami(DE3)中诱导表达人TIMP-2重组蛋白。采用亲和层析法纯化表达产物,并用Western blotting鉴定;用RNAi技术和添加外源蛋白方法分析TIMP-2蛋白对肝癌细胞迁移和侵袭的作用;荧光定量PCR、Western blotting检测siRNA-TIMP-2转染细胞后肝癌细胞内源性TIMP-2的mRNA及蛋白表达水平。结果外源添加的TIMP-2蛋白抑制肝癌细胞迁移及侵袭的能力,而RNAi技术能抑制内源的TIMP-2蛋白增强肝癌细胞迁移及侵袭的能力;肝星状细胞的条件培养液能够促进肝癌细胞迁移和侵袭,而这种作用能够被TIMP-2蛋白抑制。结论肝癌微环境中的TIMP-2蛋白水平与肝癌细胞的迁移和浸润密切相关。

桑叶水提物对2型糖尿病小鼠花生四烯酸代谢通路的影响

本文研究了桑叶水提物(mulberry leaf water extract,MLWE)对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)小鼠花生四烯酸(arachidonic acid,AA)代谢通路的影响,并探讨其对T2DM的防治作用及潜在机制。以链脲佐菌素与高脂高糖(high fat and high sucrose,HFHS)饮食构建T2DM小鼠模型,分为正常对照组(NC)、正常MLWE处理组(NCML)、糖尿病模型组(HFHS)及糖尿病模型MLWE处理组(HSML)。动物福利和实验过程获得徐州医科大学伦理委员会的批准。各组小鼠连续灌胃10周。末次给药后,检测空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)及空腹胰岛素(fasting blood insulin,FBI);实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,qPCR)法检测肝脏中AA代谢相关酶的mRNA表达;Western blot法检测肝脏中与AA代谢相关酶的蛋白表达;液质联用法测定血液中AA及相关代谢产物含量。结果显示,NCML组小鼠肝脏中AA相关代谢酶、血液中FBG、胰岛素、AA及代谢产物含量与NC组之间差异无统计学变化;与NC组相比,HFHS组小鼠肝脏中脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,Fasn)、磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)、环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)及脂氧合酶-5(lipoxygenase-5,LOX-5)表达水平、FBG、胰岛素、AA及相关代谢产物水平均显著升高,而肉毒碱棕榈酰基转移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1A,CPT1A)及细胞色素P450酶4A(cytochrome P450 family 4A,CYP4A)表达显著降低。与HFHS组比较,HSML组小鼠肝脏中Fasn、PLA2、COX-2和LOX-5的表达水平,血浆中FBG、胰岛素、AA及相关代谢产物的水平均显著下降,而CPT1A及CYP4A的表达显著增加,提示桑叶水提物可能通过改善T2DM小鼠AA代谢通路异常,发挥其防治糖尿病的作用。