利用大麦基因芯片筛选簇毛麦抗白粉病相关基因及其抗病机制的初步研究

利用大麦基因芯片筛选差异表达基因并结合RT-PCR分析技术,对簇毛麦的抗白粉病机制进行了初步研究。基因芯片杂交试验获得了抗病簇毛麦非诱导叶片、抗病簇毛麦和感病突变体经白粉菌(Blumeria graminisf.sp.tritici)诱导叶片的基因表达谱。抗病簇毛麦经白粉菌诱导前后的表达谱及RT-PCR分析,结果表明,抗病簇毛麦中乙烯和水杨酸信号途径的部分基因被白粉菌诱导增强表达,参与了白粉病的抗性过程。另外,通过比较诱导的抗病簇毛麦与诱导的簇毛麦感病突变体的表达谱并结合RT-PCR分析,发现感病突变体中乙烯和茉莉酸途径的部分基因被白粉菌诱导表达参与防卫反应,未观察到水杨酸信号途径参与防卫反应的证据。同时对抗、感簇毛麦经白粉菌诱导不同时间的叶片进行了内源水杨酸含量的测定,结果表明,抗病簇毛麦经白粉菌诱导后水杨酸含量明显上升,而感病突变体中水杨酸含量始终处于较低水平。由于乙烯信号途径是抗、感簇毛麦中共同的信号途径,而水杨酸途径只在抗病簇毛麦中参与抗病反应,所以在簇毛麦的抗病过程中,水杨酸途径是一种最有效的信号传导途径。还筛选出一批与簇毛麦抗白粉病相关的基因,包括病程相关蛋白基因、防卫反应基因、转录因子、信号传导因子和抗病基因类似物等。

受白粉菌诱导表达的簇毛麦草酸氧化酶基因(Hv-OxOLP)的克隆和分析

为了筛选抗白粉病基因Pm21介导的抗病途径中的防卫基因,采用芯片杂交技术筛选携带或不携带Pm21基因的材料之间或抗病材料经白粉菌诱导与非诱导样品之间的差异表达基因,并采用RT-PCR方法分析了被筛选出的草酸盐氧化酶类似蛋白基因(Oxalate Oxidase Like Protein,OxOLP)的表达情况,进一步利用TAIL-PCR方法分离簇毛麦基因Hv-OxOLP中的全长序列。芯片杂交结果表明,探针Contig3156(一个推导的草酸盐氧化酶类似蛋白基因)在抗病簇毛麦中受白粉菌诱导的程度最大,在抗病易位系中该探针的杂交信号比在感病扬麦5号中的杂交信号强。半定量RT-PCR结果表明,在抗、感白粉病的材料中草酸盐氧化酶类似蛋白基因都受白粉菌诱导表达,但在抗病材料中达到表达峰值的时间早。用TAIL-PCR方法分离的Hv-OxOLP有一个内含子和两个外显子,ORF包含690个核苷酸,在启动子区包含两个W-box,在终止密码子后面还有一个polyA的加尾信号。作为一个受白粉菌诱导表达的基因,Hv-OxOLP在抗白粉病反应中可能起重要的作用。

基于专化的反转录转座子序列开发鉴定簇毛麦染色质的PCR分子标记

通过克隆簇毛麦的专化序列,开发基于其序列的可用于鉴定簇毛麦染色质的PCR分子标记.用根据抗病基因保守域设计的XLS和A3简并引物进行PCR,检测到1条簇毛麦的特异PCR产物,酶切分析与测序结果表明:这条特异带由4类不同的片段组成,且都与反转录转座子具有同源性.以其中1个片段pHv29为探针进行Southern杂交,发现只有含有簇毛麦染色质的材料产生强的杂交信号,表明pHv29是一个对簇毛麦专化的反转录转座子序列.根据pHv29序列重新设计1对特异引物pHv29-F和pHv29-R,用一系列含有簇毛麦染色质的易位系或添加系的基因组DNA为模板进行PCR扩增,电泳结果表明pHv29433可以作为鉴定簇毛麦的染色质的分子标记.

栽培大豆和野生大豆耐盐性及离子效应的比较

以国际上常用的耐盐大豆 (GlycinemaxL .)品种Lee6 8为对照 ,在发芽期和苗期两个阶段 ,利用发芽指数、盐害指数和耐盐系数等指标对一年生具盐腺野生大豆 (GlycinesojaL .)和部分栽培大豆 (GlycinemaxL .)及某些野生大豆品系或品种的耐盐性进行了比较 ,讨论了耐盐指标的可行性。从离子效应方面比较了Na+ 和Cl- 对大豆发芽率的影响 ,并对具盐腺野生大豆的耐盐机理进行了初步分析。结果表明 ,大豆品种的耐盐性在发芽期和苗期无一致相关性。轻度等渗胁迫下 ,Na+ 对种子发芽率的抑制作用大于Cl- ,而重度等渗胁迫下则相反。通过减少由根系吸收的Na+ 、Cl- 向叶片的运输 ,维持叶片中较高含量的K+ ,减轻盐离子毒害 ,可能是具盐腺野生大豆耐盐的主要生理机制之一。

小麦类甜蛋白基因的转化及转基因植株的抗病性分析

目前已克隆出许多类甜蛋白基因并成功转化马铃薯、水稻和小麦等植物,均可引起植株抗病性的提高。在以往的研究中我们从小麦中克隆了一个类甜蛋白基因(Ta-Tlp),该基因在高抗白粉病的小麦6VS/6AL易位系中能够高水平表达,推测它与白粉病抗性密切相关。为进一步研究该基因的功能,本研究构建了包含在ubi强启动子控制下的Ta-Tlp基因的表达载体pAHC-TlP,用基因枪将其导入小麦品种扬麦158的幼胚愈伤组织,在含除草剂的选择培养基上经两轮筛选和分化,获得再生抗性植株。对T0、T1和T2代植株进行PCR、Southern杂交与RT-PCR分析,结果表明Ta-Tlp基因已整合进受体基因组并且能够表达。对T0代及其衍生的T1代(来自6个T0代阳性株系的183个单株)和T2代(来自6个T0代阳性株系的241个单株)转化植株进行白粉病抗性鉴定,Ta-Tlp基因超量表达的转基因植株,能延缓白粉病发病进程,其白粉病抗性有一定提高。对T2代阳性转化植株进行赤霉病抗性鉴定表明,其抗性与受体对照相比无显著差异。

普通小麦近缘物种黑麦1R、簇毛麦1V及鹅观草1Rk^(#1)染色体特异分子标记的筛选

为筛选普通小麦近缘物种黑麦1R、簇毛麦1V及鹅观草1Rk#1染色体特异分子标记,根据已定位于普通小麦第一部分同源群的EST序列设计104对STS引物,对中国春、鹅观草、黑麦及簇毛麦进行多态性分析。在104对STS引物中,有53对在对照普通小麦中国春与鹅观草、黑麦及簇毛麦之间存在多态性。利用普通小麦-黑麦1R^7R二体异附加系筛选出5对黑麦1R染色体特异标记,分别是CINAU 19-500、CINAU20-950、CINAU21-1500、CINAU22-310和CINAU23-2000;利用普通小麦-簇毛麦1V^7V二体异附加系筛选出5对簇毛麦1V染色体特异标记,分别是CINAU23-1700、CINAU24-1050、CINAU25-1650、CINAU26-500和CINAU27-620;利用鹅观草二体异附加系DA1Rk#1、异代换系DS1Rk#1(1A)、端体系DA1Rk#1L、易位系T1Rk#1S.W、长臂缺失系Del1Rk#1L筛选出5对鹅观草1Rk#1特异标记,分别是CINAU27-960、CINAU28-1360、CINAU29-480、CINAU30-560和CINAU31-520。研究表明,可以利用普通小麦的EST序列设计PCR引物,转化成STS标记,筛选普通小麦近缘物种黑麦、簇毛麦及鹅观草等染色体特异的分子标记,快速检测和追踪导入普通小麦背景中的黑麦1R、簇毛麦1V及鹅观草1Rk#1染色体或染色体片段,为深入研究普通小麦远缘杂种材料提供新的工具。

利用离果山羊草3C染色体诱导簇毛麦2V染色体结构变异

【目的】簇毛麦是普通小麦的一个近缘物种,它具有许多抗病基因,在小麦育种中起重要作用。抗白粉病基因Pm21已被南京农业大学细胞遗传所成功地转移到小麦背景中,并被广泛地用于小麦育种实践。为了进一步转移和利用定位于簇毛麦2V染色体上的有用基因,如抗眼斑病基因、抗条锈基因和护颖颖脊刚毛基因,为小麦育种创造新种质。【方法】通过普通小麦农林26-离果山羊草3C二体异附加系与小麦-簇毛麦2V(2D)二体代换系杂交,综合运用染色体C-分带、基因组原位杂交、染色体构型分析和分子标记分析。【结果】从杂种F2和F3中鉴定出涉及簇毛麦2V结构变异的异染色体系7份,包括纯合缺失系1份(Del2VS·2VL-),易位系4份,其中纯合易位2份(初步推断为T3DS·2VL,T2VS·7DL)、小片段易位1份(T6BS·6BL-2VS)和中间插入易位1份(T2VS·2VL-W-2VL),等臂染色体1份(2VS·2VS)和单端体1份(Mt2VS)。利用可分别追踪2VS和2VL的分子标记Xwmc25-120和NAU/STSBCD135-1进行PCR分析,进一步证明这7份异染色体系中涉及簇毛麦2V染色体片段。【结论】涉及2V短臂的单端体Mt2VS,等臂染色体2VS·2VS和易位系T2VS·7DL在护颖颖脊上有簇状分布的刚毛,而涉及2V长臂的易位系T3DS·2VL无刚毛,进一步证实簇毛麦护颖颖脊刚毛基因位于2VS。离果山羊草3C染色体可有效诱发簇毛麦2V染色体结构变异。

簇毛麦6V染色体短臂特异分子标记的开发和应用

为开发簇毛麦6V染色体短臂特异的分子标记,并利用这些标记对缺失系进行鉴定,选用11个RGA和17对STS引物进行多态性分析,其中1个RGA引物和1对STS引物在对普通小麦扬麦5号、簇毛麦及普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系进行多态性分析时,分别检测到一条约1000bp和约800bp的多态性片段,将这两个标记转化为稳定的特异性分子标记,分别命名为CINAU17-1086和CINAU18-723。运用这两对引物对一系列材料进行扩增,只有含6V染色体短臂的材料才能扩增出相应的特异条带,表明这两个标记均位于簇毛麦6VS上。进一步利用簇毛麦6VS缺失添加系、易位系将CINAU17-1086标记定位在簇毛麦6VSFL0.58与FL0.70之间,将CINAU18-723标记定位在簇毛麦6VSFL0.45与着丝粒之间。利用这两个特异标记对通过花粉辐射获得的部分簇毛麦6VS结构变异材料进行PCR鉴定,其结果与细胞学鉴定结果一致。CINAU17-1086和CINAU18-723标记可用来快速检测和追踪导入普通小麦背景中的簇毛麦6VS染色体片段,并对缺失系的断点进行了初步界定。

小麦—簇毛麦6VS/6AL易位染色体在不同小麦背景中的遗传稳定性及其在配子中的传递

为研究小麦-簇毛麦6VS/6AL易位染色体在不同小麦背景中的遗传稳定性及其在配子中的传递,利用高抗白粉病的普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系92R137与不抗白粉病的栽培品种百农64、百农9310、邯5310、小偃54、淮麦20、徐麦856进行杂交,并用这些品种分别与杂种F1进行正反回交。对杂种F1花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ的细胞学观察表明,在减数分裂中期Ⅰ易位染色体6VS/6AL通常以6AL与6A染色体配对形成棒状二价体。各杂种F1高抗白粉病,位于6VS上的抗白粉病基因Pm21呈显性,在F2中有69.0%-74.0%的植株抗白粉病,接近1对显性基因遗传的理论值。由于6VS与6AS在通常情况下不发生配对交换,因此可通过白粉病抗性鉴定并结合利用6VS上的分子标记来跟踪6VS/6AL易位染色体的传递。测交结果表明,以F1作母本6VS/6AL易位染色体通过雌配子的传递率为49.2%(45.8%-54.9%);以F1作父本6VS/6AL易位染色体通过雄配子的传递率为44.7%(43.1%-46.8%),均接近50%的理论值。但在各组合中,6VS/6AL易位染色体通过雄配子的传递率均低于通过雌配子的传递率。

小麦幼胚再生培养体系优化及优良转化受体基因型的筛选

为建立适于优良小麦品种遗传转化的高效组织培养体系,以20个优良小麦推广品种为材料,对以幼胚为外植体的愈伤诱导、分化和生根壮苗培养基进行筛选。结果表明,添加500 mg/L水解酪蛋白、100mg/L脯氨酸、100 mg/L谷氨酰胺,并以40 g/L麦芽糖为碳源的MXD2培养基的出愈率最高,愈伤质量最好。以大量元素减半的1/2 MX为基本分化培养基,添加1 mg/L ZT和0.5 mg/L IAA对愈伤组织诱导分化的效果最好,分化率最高达到83.0%。以1/2 MX培养基中添加0.5 mg/L IAA和0.5 mg/L MET的生根效果最好,且移栽成活率高。不同基因型的组织培养特性差异显著,筛选到扬麦158、南农9918、济麦20、宁麦9号等8个基因型可作为优良的转基因受体材料,并初步建立起适合于它们的植株再生体系。

基于EST-PCR的簇毛麦染色体特异分子标记筛选及应用

为定位、转移和利用簇毛麦有益基因,通过花粉辐射,获得一批包括小麦-簇毛麦易位染色体的异染色体系。为了鉴定这批材料中的簇毛麦染色体身份,根据水稻、小麦的EST序列合成了240对STS引物,其中34对引物在普通小麦中国春与簇毛麦间存在多态性;进一步对亲本及簇毛麦二体异附加系进行PCR扩增分析,标记CINAU32-300可追踪簇毛麦1V染色体,标记CINAU33-280、CINAU34-510、CINAU35-1100、CINAU36-380和CINAU37-400可追踪簇毛麦2V染色体,标记CINAU38-250可追踪簇毛麦3V染色体,标记CINAU39-950和CINAU40-800可追踪簇毛麦4V染色体,标记CINAU41-745和CINAU42-1050可追踪簇毛麦5V染色体,标记CINAU44-765和CINAU45-495可追踪簇毛麦7V染色体。加上本室已开发的2个6V染色体特异标记,用这些簇毛麦特异分子标记鉴定辐射诱导材料的部分回交后代,选育出小麦背景中只包含单条簇毛麦染色体的整套1V至7V染色体系,同时有18条易位染色体的簇毛麦身份得到确定,表明这些标记可以用来快速检测普通小麦背景中的簇毛麦染色体或染色体片段。

利用基于PCR的分子标记区分普通小麦-提莫菲维小麦渐渗系

采用定位于小麦2B染色体上的72对分子标记对含小麦抗白粉病基因Pm6的8份普通小麦(T.aestivum L.)-提莫菲维(T.timopheevii zhuk.)渐渗系材料进行分析,通过分子标记标图确定8份材料中渗入的提莫菲维小麦染色体片段的大小,同时结合连锁图谱对这些材料进行了遗传和物理标图。参考本研究所用的分子标记在染色体2B上的定位结果,Pm6基因被位于2B染色体长臂近末端2BL-6区域,提莫菲维小麦2G染色体渐渗片断长度由短到长排列顺序为:IGV1-465<IGV1-464<IGV1-463<IGV1-468<(IGV1-448、IGV1-458)<IGV1-474<IGV1-466。研究结果与陶文静(1999)采用RFLP标记标图的结果基本吻合,进一步确认IGV1-465渐渗片段最小。本研究所鉴定的基于PCR的分子标记还可以用于区分该套渐渗系,这为这套材料在育种中的分子标记辅助选择和Pm6基因的克隆奠定了基础。

小麦Mlo反义基因的转化及转基因植株的白粉病抗性分析

采用基因枪法将小麦反义Mlo基因导入扬麦158和济麦20的幼胚愈伤组织中,在含除草剂的分化培养基上经两轮筛选,获得抗性再生植株。PCR检测、PCR-Southern杂交、基因组DNA斑点杂交和除草剂BASTA抗性分析结果证实已获得转基因扬麦158和济麦20阳性植株,荧光定量表达分析亦证明Mlo基因发生沉默。对T0和T1代转基因植株的白粉病抗性鉴定表明,有6个转基因株系高抗白粉病。对T1代转基因小麦接种白粉菌后孢子发育的显微观察结果显示,Mlo反义基因的导入明显加快了乳突的形成和维持时间,有效抑制了吸器的发育,因而使转Mlo反义基因材料表现抗病性。

普通小麦-纤毛鹅观草染色体异附加系的分子标记鉴定

随机选取定位于小麦和大麦7个部分同源群上的135对EST、27对STS和253对SSR引物对24个可能的普通小麦-纤毛鹅观草二体异附加系的基因组DNA进行扩增。结果表明,55对引物在亲本普通小麦中国春、Inayama Komugi、纤毛鹅观草和Inayama Komugi-纤毛鹅观草双二倍体间有多态性扩增,其中31对引物可以在异附加系中扩增到纤毛鹅观草特异条带。根据PCR扩增结果,异附加系07K02、07K06、07K39、07K201、07K202、07K255和07K256所添加的纤毛鹅观草染色体归属小麦第1部分同源群;07K07、07K08、07K09、07K11、07K14和07K17所添加的纤毛鹅观草染色体归属小麦第2部分同源群;07K15、07K16、07K21和07K47所添加的纤毛鹅观草染色体归属小麦第6部分同源群。

加州野大麦染色体C-分带、荧光原位杂交及其核型分析

以二倍体加州野大麦(Hordeum californicum)及普通小麦中国春(Chinese spring,CS)-加州野大麦的双二倍体为材料,进行依次染色体C-分带和荧光原位杂交(FISH)分析。结果表明:小麦背景中的加州野大麦染色体都显示较强的末端带,7对染色体之间带的数目和强弱均存在明显差异,可以和普通小麦染色体相互区分开来;以45srDNA为探针进行荧光原位杂交发现,二倍体和双二倍体中加州野大麦的NOR位点均位于第7对染色体短臂上;基于根尖细胞有丝分裂中期染色体C-分带和原位杂交结果,利用Motic images plus 2.0 ML软件“数码显微图像处理系统”进行核型分析,确定加州野大麦的核型为2n=2x=10 m(2SAT)+4 sm,属于较为对称性核型(A);加州野大麦染色体核型的建立,为利用远缘杂交和染色体工程转移加州野大麦的有利基因奠定了基础。

矮秆基因Rht_NM9在小麦株高建成中对内源激素含量的影响

普通小麦品种"南农9918"经甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate,EMS)诱变获得一个矮秆、多蘖、长穗突变体"NM9",在该突变体中定位到一个新的矮秆突变基因Rht_NM9。内源激素在普通小麦株高建成的过程中发挥重要的调节作用,为了解析Rht_NM9致矮的生理机制,本研究以南农9918及其矮秆突变体NM9为材料,利用酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)测定了不同生育期各节间内源赤霉素(GA)、生长素(IAA)、脱落酸(ABA)和玉米素核苷(ZR)的含量,分析小麦发育关键时期的内源激素含量变化与株高的关系。结果表明,在孕穗期和抽穗期,矮秆突变体NM9中GA、ABA含量均显著高于南农9918,而ZR含量则显著低于南农9918,IAA含量在南农9918和突变体NM9之间无明显差异。此外,突变体NM9各节间中GA/ABA比值显著高于南农9918,而IAA/ABA、(IAA+GA)/ABA、ZR/ABA比值显著低于南农9918。以上结果表明小麦株高受多种激素调控,突变体中内源ABA含量升高,IAA/ABA和ZR/ABA比值降低会抑制植物株高伸长。

农杆菌介导小麦遗传转化条件的优化

本研究以普通小麦品种扬麦15和Alondra's的幼胚产生的愈伤组织为受体材料,通过检测gus基因的瞬时表达情况,研究了农杆菌介导的主要影响因子的转化效率。研究结果表明,在相同条件下两个品种农杆菌侵染的最佳条件不尽相同。扬麦15的最佳优化条件为:先在不添加AS的培养基中预培养,然后在菌液浓度为OD600=0.2、AS浓度为100μmol/L条件下侵染10min,最后在25℃共培养1d;Alondra's则在菌液浓度为OD600=0.5、共培养时间为2d时,表现出最佳的gus基因瞬时表达率。为小麦的遗传转化提供参考。

基于EST的普通小麦近缘物种第二部分同源群染色体特异分子标记

小麦近缘属物种中具有许多优良性状,为小麦遗传改良提供非常重要的基因资源。根据定位在普通小麦2B染色体长臂上的EST(expressed sequence tag,EST)序列开发了55个标记,在普通小麦品种中国春、二倍体山羊草(Aegilops longissi-ma,genome SlSl;Aegilops geniculata,genome MgMg)、四倍体山羊草(Aegilops peregrina,genome SpSpUpUp)、黑麦(Secale cereale‘BLANCO’,genome RR)、大麦(Hordeum vulgare‘BETZES’,genome HH)及这些物种在中国春背景下的二体异附加系中进行PCR扩增。结果表明:19个标记(占34.5%)至少能够在1个近缘种中有特异性扩增,筛选出2R、2H、2Sl、2Mg、2Sp和2Up染色体的特异标记分别为11、8、5、2、8和3个。这些基于EST序列开发的特异分子标记可以有效地检测和追踪导入小麦背景中的外源第二部分同源群染色体(片段)。

普通小麦品种Alondra＇s遗传转化体系的建立

小麦(Triticum aestivum)幼胚愈伤组织的诱导和分化再生有高度依赖基因型特征。为了建立和优化Alondra’s的高效再生及遗传转化体系,为小麦遗传转化提供更多的受体基因型,以Alondra’s的幼胚为外植体,研究了培养基种类、不同激素配比等对其幼胚愈伤组织诱导及再生的影响。结果表明,在使用N6培养基时,添加3mg·L-1的2,4-D并附加1000mg·L-1的CH对愈伤组织的诱导效果较好;添加4mg·L-1的ZT、不附加IAA对愈伤组织的分化效果最好。通过构建植物表达载体pCAMBIA1301-220.6,利用基因枪法将HYG基因导入Alondra’s幼胚愈伤组织中,以建立Alondra’s的高效遗传转化体系。结果在含100mg·L-1潮霉素的选择培养基上进行筛选、分化,获得了30棵抗性植株。经PCR检测,其中5株为阳性转基因植株,转化率为0.5%。Alondra's遗传转化体系的建立丰富了小麦遗传转化的基因型,为小麦品种的转基因改良和在不同背景下研究基因的功能奠定了良好的基础。

分子标记辅助选育小麦抗白粉病、优质高分子量麦谷蛋白亚基聚合体

现代小麦育种的目标是选育丰产、综合抗逆性好的优质小麦新品种,将分子标记技术与传统育种方法相结合可以大大提高育种效率。本研究利用与小麦抗白粉病基因Pm21紧密连锁的共显性PCR标记、以及优质高分子量麦谷蛋白亚基1Dx5+1Dy10特异的PCR标记对以小麦品种安农94212、安农92484为优质亲本和以抗白粉病小麦—簇毛麦易位系为抗病亲本的杂交高代材料进行标记位点的检测,结合田间抗病性鉴定结果,筛选、培育出聚合有Pm21和1Dx5+1Dy10的抗白粉病小麦聚合体,为小麦抗病、优质育种提供了具有重要利用价值的中间材料。