氯化镉对小鼠睾丸指数及其线粒体ATPase6、D-Loop基因突变的影响

背景与目的:研究氯化镉对睾丸指数及睾丸细胞线粒体ATPase6、D-Loop基因突变的影响。材料与方法:取40只体重(19.5±2.5)g的雄性ICR小鼠,随机分为4组,每组10只,分别以1、5、10μmol/kg氯化镉腹腔注射,隔天注射1次,共10次,同时设阴性对照组(生理盐水)。第21天取小鼠双侧睾丸称重并计算睾丸指数;提取睾丸组织基因组DNA,PCR扩增线粒体ATPase6、D-Loop基因,纯化后测序分析基因突变。结果:10μmol/kg氯化镉组睾丸指数显著低于对照组(P<0.01),未检测到小鼠睾丸细胞线粒体ATPase6、D-Loop基因的突变。结论:10μmol/kg浓度的氯化镉可致小鼠睾丸指数降低,氯化镉短期处理(21 d内)未能引起小鼠睾丸线粒体ATPase6、D-Loop基因突变。睾丸指数与细胞线粒体ATPase6、D-Loop基因突变可能不存在相关性。

线粒体DNA序列分析封闭群小鼠遗传稳定性

目的分析ICR小鼠线粒体ATPase6和D—Loop基因多态性及封闭群ICR小鼠遗传稳定性。方法在一个亲本雌鼠100只繁殖产生的共1000只后代群体中随机取12周龄雄鼠20只，提取小鼠睾丸生殖细胞DNA，PCR扩增小鼠线粒体ATPase6和D-Loop基因，产物纯化后测序，测序结果与小鼠线粒体标准序列比对，比较20只小鼠的序列差异。结果检测的20只小鼠ATPase6和D—Loop基因序列完全一致，且与小鼠线粒体标准序列完全一致。结论ICR小鼠群体内未检测到ATPase6和D—Loop基因的多态性变异，该群体具有较好的线粒体遗传稳定性。

髓样分化蛋白2基因沉默对高糖诱导的大鼠心肌细胞增殖抑制、凋亡及炎症反应的影响

目的:研究髓样分化蛋白2(MD2)基因沉默对高糖(HG)诱导的大鼠心肌细胞增殖抑制、凋亡及炎症反应的影响及其机制。方法:体外大鼠心肌细胞系H9C2细胞随机分为4组(n=3):LG组、HG组、HG+NC组、HG+si-MD2组,分别转染MD2基因小干扰RNA(si-MD2)或阴性对照24h后进行低糖或高糖处理48h。RT-qPCR检测MD2及细胞内炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平,MTS法、流式细胞术检测细胞增殖能力、细胞周期和细胞凋亡率,Westernblot法检测细胞内相关蛋白的表达水平及磷酸化水平。结果:转染si-MD2后,H9C2细胞中MD2的表达水平明显下降(P<0.01)。与低糖(LG)组比较,高糖处理后的H9C2细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平显著升高,细胞增殖能力下降并发生G1期阻滞,细胞凋亡率和CleavedCaspase-3蛋白水平升高(P<0.01)。而MD2基因沉默可拮抗高糖对H9C2细胞增殖、细胞周期、凋亡及细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA水平的影响(P<0.05)。Westernblot测定结果表明高糖处理后的H9C2细胞中细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)和C-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白的磷酸化水平明显升高,而MD2基因沉默可抑制高糖诱导下的ERK1/2、P38MAPK和JNK蛋白激活(P<0.01)。结论:MD2基因沉默可能通过抑制ERK、P38MAPK和JNK信号通路的激活来减少高糖诱导的大鼠心肌细胞炎症细胞因子表达,减少心肌细胞凋亡,促进细胞增殖。

氯化镉对小鼠脏器系数及睾丸生殖细胞线粒体D-Loop基因突变的影响

[目的]研究氯化镉对发育中的小鼠睾丸、肾、肝等脏器系数及对睾丸生殖细胞线粒体DNA控制区(D-Loop)基因突变的影响,探索氯化镉对睾丸影响的机制。[方法]取7周龄雄性ICR小鼠40只[体重(19.5±2.5)g],随机分为低(1μmol/kg)、中(5μmol/kg)、高(10μmol/kg)剂量氯化镉腹腔注射染毒组和阴性对照组共4组,每组10只,隔天染毒,共10次,对照组腹腔注射等体积的生理盐水。第21天取小鼠双侧睾丸、肾和肝,测定脏器系数;提取睾丸生殖细胞基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)扩增线粒体D-Loop基因,纯化后测序分析基因突变。[结果]高剂量组睾丸脏器系数明显低于对照组(P<0.001),但肝脏器系数明显高于对照组(P<0.05);低剂量组肾脏脏器系数明显高于对照组(P<0.001)。测序结果显示各组小鼠睾丸生殖细胞线粒体D-Loop基因未检测到突变。[结论]高剂量的氯化镉对小鼠睾丸和肝脏脏器系数产生影响,低剂量的氯化镉对小鼠肾脏脏器系数产生影响。氯化镉处理小鼠21d,未检测到睾丸生殖细胞线粒体D-Loop基因突变。

镉对果蝇肠道上皮细胞损伤和调控中肠干细胞增殖、分化机制的研究

重金属元素镉具有较强的生物毒性,是威胁人类健康的重要环境污染物质。为探索镉的过量摄入对生物消化系统的潜在影响,以果蝇中肠系统为实验模型,以不同浓度的氯化镉作为处理因素,探讨其对肠道细胞的损伤作用和调控中肠干细胞增殖、分化的相应机制。通过透射电镜观察,发现镉对果蝇中肠上皮细胞超微结构具有损伤作用,并且损伤程度具有显著的浓度依赖性;免疫荧光结果证实,镉的过量摄入对中肠干细胞(intestinal stem cell,ISC)、成肠细胞(enteroblast,EB)和肠上皮细胞(enterocyte,EC)的数量和比例能够产生影响,且显著促进中肠干细胞的增殖;Real-time RT-PCR检测结果表明,肠道组织中表皮生长因子受体(epidermal growth factor recep-tor,EGFR)和JAK/STAT信号通路配体基因的转录水平显著提高,JAK/STAT信号通路同时被大幅度活化。结果显示:高浓度镉的摄入对果蝇中肠上皮细胞核膜、线粒体和微绒毛等超微结构造成损伤,该类损伤能够诱使果蝇肠道组织上调表达相关配体蛋白,从而激活干细胞的EGFR和JAK/STAT信号通路,从而促进ISC的增殖与分化能力,继而实现对肠道损伤组织进行及时的修复。然而,中肠干细胞增殖信号通路的持续激活以及干细胞的过度增殖同样具有诱发肠道肿瘤发生的潜在可能。

microRNA-127抑制葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的表观遗传调控研究

目的:研究microRNA-127(miR-127)在人葡萄膜黑色素瘤细胞中的表达水平及其对细胞增殖的影响。方法:实验研究。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测miR-127在葡萄膜黑色素瘤细胞M23和SP6.5与正常葡萄膜黑色素细胞UM95中的表达水平。细胞实验通过阳离子脂质体介导的方法将miR-127和阴性对照(NC)转染入M23和SP6.5中,并应用细胞增殖实验法(MTS法)和流式细胞技术分别检测细胞增殖能力和细胞周期,采用WesternBlot法检测转染miR-127后细胞周期相关蛋白的表达。另外,通过RT-qPCR检测用表观药物5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-dC)和(或)曲古抑菌素A(TSA)处理后的M23和SP6.5细胞内miR-127的表达水平。MiR-127的表达量及细胞实验各参数在2组间比较采用独立样本t检验。结果:miR-127在M23和SP6.5中的表达水平低于UM95(t=72.2、591.5,P<0.001)。MTS结果显示,在M23和SP6.5细胞中,转染miR-127组相对细胞数目较NC组的100%分别减少至(62.3±4.2)%和(65.4±2.3)%,差异具有统计学意义(t=12.7、21.6,P<0.001)。流式细胞技术分析显示,转染miR-127组处于G0/G1期的M23和SP6.5细胞数量比例明显高于NC组(t=-6.7,P=0.003;t=-9.9,P<0.001),同时处于S期的M23和SP6.5细胞数量比例明显低于NC组(t=8.6,P=0.001;t=12.7,P<0.001)。WesternBlot结果表明miR-127可明显降低M23和SP6.5细胞内磷酸化Rb蛋白的表达水平(t=22.2、15.6,P<0.001)。此外,miR-127在M23和SP6.5细胞中的表达可被5-Aza-dC和TSA诱导上调(P<0.05)。结论:miR-127通过抑制细胞周期而抑制人葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖,并可被DNA甲基化和组蛋白乙酰化表观遗传机制调控。

microRNA-182抑制人角膜上皮细胞增殖和迁移

目的:通过体内动物实验与体外细胞实验来阐明microRNA-182(miR-182)在角膜上皮损伤修复中的功能。方法:实验研究。体内实验选取5只C57BL/6J野生型小鼠,通过机械刮伤法构建小鼠角膜上皮损伤修复模型作为实验组,对侧眼作为对照组,通过实时定量RT-PCR法检测miR-182在损伤修复过程(损伤后48h)的表达。体外实验采用脂质体介导的方法将miR-182和随机序列寡核苷酸链转染入人角膜上皮细胞(HCECs),通过细胞增殖实验(MTS法)和细胞克隆形成实验检测细胞增殖和生长能力,流式细胞术检测细胞周期,细胞划痕实验检测细胞迁移能力。MiR-182表达量及细胞实验各参数2组间比较采用独立样本t检验。结果:体内实验中,与对照组相比,实验组中5个样本量的miR-182在角膜上皮损伤修复过程中表达水平显著下调(t=147.6、79.2、136.8、41.3、89.8,均P<0.001)。体外实验中,miR-182组相对细胞数目为(81±5)%,与阴性对照组(100%)相比显著减少(t=6.6,P=0.003),同时miR-182组细胞克隆数明显少于阴性对照组。细胞周期检测结果显示实验组处于G1期细胞数量比例为(49±7)%,明显高于阴性对照组的(35±4)%(t=-3.0,P=0.041)。此外,细胞迁移实验结果显示miR-182组HCECs细胞迁移的距离为(99±12)μm,而阴性对照组的迁移距离为(213±14)μm(t=10.8,P=0.001),迁移速度明显变慢。结论:miR-182通过抑制角膜上皮细胞的增殖与迁移,从而对角膜上皮损伤修复起到负调控的作用。

MicroRNA-199a-3p对脉络膜黑色素瘤细胞增殖的抑制作用

目的:探讨MicroRNA-199a-3p(miR-199a-3p)对脉络膜黑色素瘤细胞OCM290增殖的影响及机制。方法:实验研究。首先采用Real-time PCR技术检测miR-199a-3p在正常的脉络膜黑色素细胞UM96和肿瘤细胞OCM290中的表达情况;其次采用阳离子脂质体Lipofectamine介导的转染方法,将miR-199a-3p转染入体外培养的人脉络膜黑色素瘤细胞OCM290中过表达作为实验组,将随机序列寡核苷酸链转染入OCM290细胞作为阴性对照组;然后在转染的基础上运用细胞增殖实验法(MTS法)、克隆形成实验检测细胞增殖和生长能力。流式细胞术检测细胞周期。Western blot法检测与细胞周期相关的信号蛋白如CDK2、CDK4、E2F1等的表达。组间数据比较采用独立样本t检验。结果:miR-199a-3p在UM96中高表达,而在OCM290中表达明显下调(t=13.2,P<0.001)。OCM290细胞转染miR-199a-3p后,MTS结果显示实验组细胞数为对照组的(23.8±1.7)%,细胞增殖明显被抑制(t=78.1,P<0.001);细胞克隆数减少;细胞周期滞留在G1期(t=-8.5,P=0.001);Western blot法检测发现miR-199a-3p能下调OCM290中CDK2、CDK4、E2F1等的表达水平(t=10.3,P=0.001;t=9.9,P=0.001;t=10.4,P<0.001)。结论:miR-199a-3p通过下调调控细胞周期进程的关键蛋白,影响细胞周期的进程,从而抑制脉络膜黑色素瘤细胞的增殖。