Hsa_circ_0016600/miR-1298/TGFA轴促进人肺腺癌细胞增殖和迁移的作用机制

目的 目前对于Hsa_circ_0016600是否通过miR-1298/TGFA轴通路参与肺腺癌的发生过程尚不清楚。文中旨在探讨Hsa_circ_0016600对肺腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其对miR-1298/TGFA通路的调控作用。方法 通过高通量测序技术对5对肺癌组织及癌旁组织进行检测,筛选出具差异性的环状RNA Hsa_circ_0016600,利用mirTarbase和TargetScan数据库预测、荧光素报告酶实验验证Hsa_circ_0016600与miR-1298、miR-1298与TGFA的相互作用;利用qRT-PCR技术检测Hsa_circ_0016600在肺腺癌组织及细胞系中的表达情况。根据转染肺腺癌细胞不同分为:Si-NC组(Si-NC转染肺腺癌细胞)、Si-circ组(Si-hsa_circ_0016600转染肺腺癌细胞)、Si-TGFA组(Si-TGFA转染肺腺癌细胞)、miR-NC组(miR-1298-NC转染肺腺癌细胞)、miR-mimics组(miR-1298-mimics转染肺腺癌细胞)、miR-inh组(miR-1298-inhibitors转染肺腺癌细胞)、Si-circ+miR-NC组(Si-circ、miR-NC转染肺腺癌细胞)、Si-circ+miR-inh组(Si-circ、miR-inh转染肺腺癌细胞)、si-NC+miR-NC组(si-NC、miR-NC转染肺腺癌细胞)、miR-NC+pcDNA3.1组(miR-1298-NC、pcDNA3.1转染肺腺癌细胞)、miR-mimics+TGFA组(miR-mimics、TGFA转染肺腺癌细胞)和miR-mimics+pcDNA3.1组(miR-mimics、pcDNA3.1转染肺腺癌细胞)。应用克隆形成实验、划痕实验及Transwell侵袭实验检测上述干预对细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响;通过蛋白免疫印迹法检测经上述分组干预后对目的蛋白TGFA表达的影响。结果 高通量测序筛选出在肺腺癌组织中高表达的环状RNA hsa_circ_0016600。克隆形成实验显示,A549和PC9中Si-circ组的克隆形成率[(2.07±0.40)、(2.90±0.40)]明显低于Si-NC组[(5.33±0.35)、(7.30±0.36)],差异有统计学意义(P<0.05);细胞划痕实验表明,A549和PC9细胞中Si-circ组的迁移率较Si-NC组明显降低(P<0.05);Transwell侵袭实验显示,A549和PC9细胞中Si-circ组的侵袭细胞数明显低于Si-NC组(P<0.05)。A549和PC9中Si-TGFA组的克隆形成率、侵袭细胞数、迁移率明显低于Si-NC组(P<0.05)。与Si-circ+miR-NC组比较,Si-circ+miR-inh组细胞克隆形成率在A549细胞及PC9细胞中明显升高(P<0.01);划痕实验显示,Si-circ+miR-inh组A549及PC9的迁移率较Si-circ+miR-NC组增高(P<0.01);侵袭实验表明,Si-circ+miR-inh组A549及PC9侵袭细胞数较Si-circ+miR-NC组明显增多(P<0.01)。miR-mimics+TGFA组TGFA的表达、侵袭细胞数、细胞迁移率较miR-mimics+pcDNA3.1组增加(P<0.01)。结论 Hsa_circ_0016600/miR-1298/TGFA轴促进人肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭,为肺腺癌的治疗提供新的理论依据。

Hsa_circ_0003449在人胃癌中表达及对胃癌细胞增殖和迁移作用

环状RNA是一种特殊的非编码RNA,在肿瘤发生发展中起着重要作用。通过高通量测序技术对5对确认为癌组织及癌旁正常组织进行检测,分析筛选出差异性环状RNA hsa_circ_0003449,通过qRT-PCR进行验证后,使用siRNA进行基因敲减,利用细胞克隆试验、平板划痕试验及transwell试验等检测胃癌细胞功能的改变,通过生物信息网站预测基因靶点TP73蛋白,敲减hsa_circ_0003449后检测蛋白质水平上的改变。结果表明:在人胃癌组织中,hsa_circ_0003449表达水平明显高于癌旁正常组织;在胃癌患者血清中,hsa_circ_0003449表达水平也高于健康体检者血清中表达水平;在胃癌细胞株(SGC-7901、BGC-823、HGC-27、MGC-803)中,hsa_circ_0003449表达水平均高于正常人胃黏膜上皮细胞株(GES-1)。在人胃癌细胞株中通过siRNA对hsa_circ_0003449的敲减引起肿瘤增殖及迁移能力下降。同时胃癌细胞株中hsa_circ_0003449的敲减会引起靶点TP73蛋白的表达水平下降。这一研究成功验证了hsa_circ_0003449在胃癌中高表达,且敲减hsa_circ_0003449后可抑制人胃癌细胞增殖、迁移等能力,为进一步探究hsa_circ_0003449成为胃癌早期诊断标志物和治疗靶点提供了理论基础。

Hsa_circ_0000128通过miR-623/EIF4A1轴促进人胃腺癌细胞增殖和迁移的机制研究

目的目前对于hsa_circ_0000128是否通过miR-623/EIF4A1轴通路参与胃腺癌的发生过程尚不清楚。文中旨在研究环状RNA hsa_circ_0000128(Circ_01607)在胃腺癌组织、细胞株的表达以及对胃癌细胞的增殖、迁移、凋亡的影响。方法收集2019年9月至2020年8月江苏大学附属人民医院病理科的40份胃腺癌及癌旁组织标本。进行高通量测序筛选出表达明显提高的环状RNA hsa_circ_0000128;通过circBank、TargetScan等数据库预测下游miR-623。采用RT-PCR对40例临床胃腺癌组织、癌旁组织、胃癌细胞株(MGC-803,HGC-27,BGC-823)以及正常人胃粘膜上皮细胞株GES-1中hsa_circ_0000128的表达进行测定及验证结果。挑选出表达量差异最大的两组进行后续实验。将HGC-27、MGC-803细胞株分别接种于两块细胞培养板中,培养板中设置相应的circRNA组别:Si-NC组(Si-NC转染胃腺癌细胞)、Si-circ组(si-hsa_circ_0000128转染胃腺癌细胞)、Si-EIF4A1组(Si-EIF4A1转染胃腺癌细胞)、miR-NC组(miR-623-NC转染胃腺癌细胞)、miR-mimics组(miR-623-mimics转染胃腺癌细胞)、miR-inh组(miR-623-inhibitors转染胃腺癌细胞)、Si-circ+miR-NC组(Si-circ、miR-NC转染胃腺癌细胞)、Si-circ+miR-inh组(Si-circ、miR-inh转染胃腺癌细胞)。采用克隆形成实验测定各组细胞增殖能力;使用Transwell实验测定各组胃癌细胞的迁移能力;蛋白免疫印迹实验测定凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3、bcl-2和Bax的表达水平验证细胞凋亡情况。验证miR-623在组织及细胞中的表达情况,通过荧光素酶实验验证结合靶点信息,加入miRNA对应干扰并将其分组,通过细胞功能学实验,蛋白印迹实验比较胃癌细胞株各组细胞功能的变化。通过PCR及蛋白免疫印迹实验验证各组真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)的相关表达水平与miR-623含量的关系。结果hsa_circ_0000128在胃癌组织及细胞株中较癌旁组织及正常胃黏膜上皮细胞中呈高表达状态。SI-circ组hsa_circ_0000128的相对表达量明显低于SI-NC组(P<0.05)。SI-circ+miR-inh组miR-623含量较SI-circ+miR-NC组下降(P<0.05)。SI-circ组Cleaved-caspase-3、Bax相对表达量较SI-NC组增加(P<0.05),Bcl-2相对表达量下降(P<0.05)。HGC-27和MGC-803细胞中Si-circ组的克隆形成率[(11.57±1.724)%、(12.47±2.401)%]明显低于Si-NC组[(32.53±3.250)%、(25.07±1.557)%],差异有统计学意义(P<0.05)。加入miR-623 inhibitor后可逆转抑制现象,SI-circ+miR-NC组克隆形成率[(10.43±1.305)%、(12.50±1.400)%]明显低于Si-circ+miR-inh组[(25.03±1.665)%、(19.63±1.955)%],差异具有统计学意义(P<0.01)。Transwell实验表明,SI-circ组较SI-NC组迁移明显降低(P<0.05)。EIF4A1在40对胃癌组织及胃癌细胞株HGC-27、MGC-803表达较癌旁组织、正常胃黏膜上皮细胞GES-1中呈高表达,差异具有统计学意义(P<0.01)。蛋白免疫印迹实验显示当敲减hsa_circ_0000128时,EIF4A1的含量下降;当加入miR-623 inhibitor逆转敲减circRNA情况时,EIF4A1的表达含量上升(P<0.01)。结论hsa_circ_0000128在胃癌细胞株、组织中呈高表达,hsa_circ_0000128作为miR-623的海绵上调EIF4A1促进胃癌细胞的生物学功能;含量下调后可显著抑制胃癌细胞增殖、迁移并诱导其凋亡。

hsa_circ_0026782对肺腺癌细胞的增殖、迁移及凋亡作用

目的环状RNA(circRNA)可调节肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移,而影响肿瘤患者预后,而环状RNA(circRNA)在肺腺癌中作用的机制尚不清楚。文章探讨环状RNA hsa_circ_0026782在肺腺癌患者中的差异表达及对肺腺癌细胞的增殖、迁移及凋亡的影响。方法通过高通量测序检测肺腺癌组织及癌旁组织中有显著差异的环状RNA hsa_circ_0026782;通过实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术检测肺腺癌组织与癌旁组织、肺癌患者血清、术后血清与健康体检人、肺腺癌细胞系(PC9,A549,H1975)及正常细胞系(BEAS-2B)之间hsa_circ_0026782的表达水平。选择下调最为显著的肺腺癌A549细胞进行过表达质粒转染(circ_0026782),选择下调相对较少的PC9细胞进行siRNA敲减(si-circ_0026782),使用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术检测过表达组(circ_0026782)与空质粒组(Empty-vector)、敲减组(si-circ_0026782)与对照组(si-NC)效率;通过对肺腺癌细胞进行平板细胞克隆形成实验、CCK-8(Cell-Counting Kit-8)实验检测hsa_circ_0026782对肺腺癌细胞的增殖作用的影响;通过划痕实验和Transwell迁移实验检测hsa_circ_0026782对肺腺癌细胞迁移的作用;通过qRT-PCR检测CMTM4 mRNA表达水平,通过蛋白免疫印迹实验(Western-Blot)检测增殖相关标志物、凋亡相关标志物及目的蛋白CMTM4表达水平。结果相对于空载体组(1.19±0.52),转染过表达质粒组(534.2±39.12)能明显提高hsa_circ_002678的表达;相对于对照组(si-NC)(1.06±0.13),用小干扰RNA敲减hsa_circ_0026782(si-circ_0026782)(0.052±0.004)能明显减少hsa_circ_0026782的表达。平板克隆实验、CCK-8实验及Western blot实验结果均表明,hsa_circ_0026782的表达上调可明显抑制肺腺癌细胞增殖,敲减hsa_circ_0026782的表达下调可明显促进肺腺癌细胞的增殖D过表达hsa_drc_0026782(circ_0026782)可促进肺腺癌细胞凋亡,敲减hsa_drc_0026782(si-circ_0026782)可抑制肺腺癌细胞凋亡。细胞划痕实验表明,在A549细胞中,过表达hsa_circ_0026782(circ_0026782)组较空载体(Empty-vector)组可抑制细胞迁移;PC9细胞中,siRNA敲减hsa_circ_0026782组(si-cire_0026782)组较阴性对照组(si-NC)组促进细胞迁移,Transwel]实验表明,在A549细胞中,过表达hsa_circ_0026782(circ_0026782)组较空载体(Empty-vector)组的细胞迁移数明显下降;siRNA敲减hsa_circ_0026782(si-circ_0026782)组较阴性对照组(si-NC)细胞迁移数明显增多。过表达hsa_circ_0026782(circ_0026782)组(4.877±0.769)较空载体(Empty-vector)(0.948±0.229)组CMTM4 niHNA表达量增加;siRNA敲减hsa-ccirc_0026782(si-circ_0026782)组(0.167±0.07423)较阴性对照组(si-NC)组(1.166±0.311)CMT M4 mRNA表达量下降。Western Wot实验结果表明,过表达hsa_circ_0026782(circ_0026782)组较空载体(Empty-vector)组CMTM4蛋白表达量增加,敲减hsa_circ_0026782(Si-Circ_0026782)组较阴性对照组(si-NC)CMTM4蛋白表达量下降:结论。hsa_circ_0026782可通过CMTM4抑制肺腺癌的发生发展,有望成为肺腺癌诊断及干预治疗的靶点。

CircRNA_23113抑制肺腺癌细胞的增殖和迁移

目的探究circRNA_23113在肺腺癌中的表达及对肺腺癌细胞增殖和迁移的影响。方法通过高通量测序技术测序5例临床肺腺癌、癌旁组织标本,筛选出差异性表达的circRNA_23113。实时荧光定量PCR检测肺腺癌组织、血清和细胞中circRNA_23113的表达;构建circRNA_23113的过表达质粒,用CCK-8法、克隆形成实验、细胞划痕和Transwell小室法分析其对细胞增殖和迁移的影响;用Western blot检测β-catenin、cyclin D1以及c-myc蛋白水平的表达。结果CircRNA_23113在肺腺癌患者组织、血清和细胞中显著低表达(P<0.05);过表达circRNA_23113后抑制A549和H1299细胞增殖和迁移(P<0.05);CircRNA_23113抑制β-catenin、cyclin D1以及c-myc表达(P<0.05)。结论CircRNA_23113在肺腺癌中低表达,且过表达能抑制肺腺癌细胞的增殖和迁移。

circBMPR2竞争性结合miR-6814-5p抑制肺腺癌细胞的作用机制

目的环状RNA(circRNA)参与肺腺癌的发生发展过程,然而作用机制有待进一步研究。文章旨在探究circBMPR2对肺腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响及调控机制。方法收集30对肺腺癌组织和癌旁组织,其中5对标本进行高通量测序,根据高通量测序结果选取显著差异性表达的circBMPR2。利用qRT-PCR检测25对肺腺癌组织及癌旁组织、肺腺癌细胞系(A549、H1975、PC9)和正常支气管黏膜上皮细胞(BEAS-2B)中circBMPR2的表达水平。过表达质粒转染PC9细胞;小干扰RNA转染A549细胞,共分为两组对照,分别是PC9细胞OE-circ及对照组circ-NC,A549细胞si-circ及对照组si-NC。利用平板克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell实验检测细胞的增殖、迁移和侵袭能力。用蛋白质印迹法检测上皮间质转化(EMT)相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)的表达水平。通过双荧光素酶实验及qRT-PCR验证circBMPR2与miR-6814-5p的靶向关系。通过蛋白质印迹法验证ARID1A是miR-6814-5p靶基因。结果circBMPR2在肺腺癌组织(0.30±0.10)中的表达水平较癌旁组织(1.00±0.29)低(P<0.05)。与正常支气管黏膜上皮细胞相比,3株肺腺癌细胞株中的circBMPR2相对表达水平均低(P<0.05)。与circ-NC组相比,OE-circ组PC9细胞克隆形成率、细胞迁移率、侵袭细胞数下降且N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达量低(P<0.05),E-cadherin蛋白相对表达量高(P<0.05)。与si-NC组相比,si-circ组A549细胞细胞克隆形成率、细胞迁移率、侵袭细胞数上升且N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达量高(P<0.05),E-cadherin蛋白相对表达量低(P<0.05)。qRT-PCR实验表明,PC9细胞中OE-circ组miR-6814-5p相对表达水平(0.47±0.04)较circ-NC组(1.00±0.16)降低(P<0.05);A549细胞中si-circ组miR-6814-5p相对表达水平(2.51±0.60)较si-NC组(1.00±0.12)明显升高(P<0.05)。结论circBMPR2通过竞争性结合miR-6814-5p促进ARID1A的表达,抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,抑制肺腺癌细胞的上皮间质转化,有望成为肺腺癌治疗的潜在治疗靶点。