新疆伊犁2005年甲型肝炎病毒流行株基因分型研究

为了解2005年新疆伊犁甲型肝炎病毒（甲肝病毒）流行株分子流行病学特征，收集了部分甲肝病人血清标本，用国际上通用的甲肝病毒结构区基因VP1—2A分型引物，经核酸提取，做RT-PCR，序列测定，对甲肝病毒基因进行分型研究，并对甲肝病毒在甲型肝炎（甲肝）病人血清中存在的时间进行了探讨。结果显示，甲肝病毒核苷酸序列变异在0～3．2％之间，分为不同的基因簇，但都属于1A亚型（同一基因亚型间核苷酸序列变异小于7．5％）;氨基酸序列几乎相同。甲肝发病8周后的病人血清中仍能检测到甲肝病毒。结果说明该流行区有多株甲肝病毒存在，其传染源可能有多个传播途径，当人群免疫水平较低时，可引起甲肝流行。甲肝病毒在病人血液中可存在较长时间。这些工作为今后进一步开展甲肝病毒溯源研究及有效控制甲肝病毒流行提供了理论和技术支撑。

人源中和性抗甲型肝炎病毒抗体Fab段基因的序列分析及可溶性表达

在用噬菌体表面呈现系统获得人源抗甲型肝炎 (甲肝 )病毒中和性基因工程Fab抗体的基础上 ,对所获得的 4株中和性Fab抗体轻重链可变区基因进行了序列分析、可溶性表达及生物学特性鉴定。 4株Fab抗体重链可变区拥有 99%同源的核苷酸序列和相同的CDR区氨基酸序列 ,属于VHⅢ基因家族。而轻链可变区核苷酸序列同源性为 95 %和相似的CDR区氨基酸序列 ,属于VL5基因家族。这些重组抗体都能与人甲肝恢复期血清及具有中和活性的鼠抗甲肝单克隆抗体产生竞争抑制反应 。

丙型肝炎病毒基因组部份NS5区蛋白基因在大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中表达了丙型肝炎病毒基因组ＮＳ５区Ａ段和部份Ｂ段蛋白。ＮＳ５Ａ蛋白溶于水，可经过ＧＳＴ亲和层析柱纯化；ＮＳ５Ｂ蛋白不溶于水，经ＰＢＳ－ＴｒｉｔｏｎＸ－１００洗涤，尿素溶解后，通过离子交换柱纯化。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，ＮＳ５Ａ蛋白除在５７ｋＤ左右有条带外，还有不同程度的降解产物；ＮＳ５Ｂ蛋白主要在５８ｋＤ左右有条带出现。为查明表达蛋白抗体在病人血清中的分布，取９４份已经Ｃ３３ｃ或Ｃ２２检测过的血清，用间接ＥＬＩＳＡ法查抗体，结果在７１份Ｃ３３ｃ或Ｃ２２阳性血清中，抗ＮＳ５Ａ抗原的抗体检出率为６４．８％；抗ＮＳ５Ｂ的检出率为５７．７％；ＮＳ５Ａ和ＮＳ５Ｂ蛋白抗体的总符合率为７５．５％。暂时未发现单独抗ＮＳ５Ａ或ＮＳ５Ｂ抗体阳性的血清。

Pichia pastoris酵母中表达人源中和性抗甲型肝炎病毒scFv-Fc融合抗体的研究

为了探讨人源抗甲型肝炎(甲肝)病毒scFv-Fc融合抗体在酵母中的表达特性,将获得的人源抗甲肝病毒中和性单链可变区抗体(scFv抗体)基因克隆入含信号肽及人IgG1Fc抗体基因的酵母细胞表达载体中,获得了一株中和性人源抗甲肝病毒pPiscFv-FcHA16融合抗体的分泌表达,并对表达产物进行了纯化。同时对表达产物的生物学特性进行了一系列鉴定。表达的pPiscFv-FcHA16融合抗体为具有不同糖基化形式的同源二聚体,与相应的CHO细胞表达的IgG抗体相比,pPiscFv-FcHA16融合抗体仍保持很好的抗原结合活性,以及与中和性鼠抗甲肝病毒单克隆抗体的竞争抑制能力。同时也保持了对甲肝病毒的体外中和活性。这些结果表明,在酵母中表达的单链可变区(scFv)与IgG1Fc区的融合抗体具有很好的生物学活性,有希望用做体外诊断,用纯化相应的抗原,或者可能用于体内预防与治疗。

戊型肝炎病毒结构区基因在大肠杆菌中的表达及其在诊断中的应用

利用融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ表达了戊型肝炎病毒第二（ＯＲＦ２）和第三读码框（ＯＲＦ３）区的两个抗原表位，并利用ＯＲＦ２表位上游自然存在的限制性内切酶位点和ＯＲＦ３下游通过ＰＣＲ引入的限制性内切酶位点，使两个免疫表位区域形成嵌合。表达的三种抗原均溶于水。可利用商品化的谷胱甘肽－４Ｂ亲合层析柱得到纯化的抗原。经试用发现，基因重组抗原作为酶联免疫试剂的抗原用于检测血清中抗戊型肝炎病毒抗体，与新加坡进口试剂盒有高度的一致性。

丙型肝炎病毒RNA打点杂交检测方法同RT－PCR方法的比较

采用ＨＣＶ基因组结构区Ｃ区ｃＤＮＡ探针和非结构区ＮＳ３－４区ｃＤＮＡ探针，建立了用打点杂交（ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法，同采用ＨＣＶ基因组５’端非编码区的一对寡核苷酸引物通过逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法相比较，发现两种方法都能快速早期和特异地检出血清中ＨＣＶＲＮＡ，但ＲＴ－ＰＣＲ法敏感性优于ＲＮＡ打点杂交法。对于无血清学指标的慢性ＮＡＮＢ肝炎病人的诊断，可采用这两种方法。这两种方法的敏感性在很大程度上依赖于引物和探针的敏感性，以及ＲＮＡ提取方法。ＲＴ－ＰＣＲ法适用于诊断病毒血症和复制，打点杂交法适用于研究ＨＣＶＲＮＡ量的变化，对治疗的评价，以及为实验筛选较高滴度的ＨＣＶＲＮＡ阳性样本。

不同消毒剂对HBV核酸和表面抗原的作用效果研究

目的评价实验室常用的消毒剂对乙型肝炎病毒(HBV)的核酸和表面抗原的作用效果。方法采用悬液法将不同消毒剂与HBV混合,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)评价消毒剂对乙肝表面抗原(HBsAg)的作用效果,通过实时荧光定量PCR评价消毒剂对HBV DNA的作用效果。结果对于高浓度的HBV核酸和HBsAg,1%卫可(Virkon)处理1h可使HBV DNA和HBsAg变为阴性,含氯消毒剂和75%乙醇仅对低浓度HBV血清有效,而过氧化氢对所有浓度的HBV核酸和HBsAg效果都不明显。结论当实验室发生HBV阳性血清溅洒等生物安全事故时,采用20~40倍体积1%卫可处理1h较为适宜。

2019年青岛市3例有摩洛哥旅行史甲型肝炎病例感染甲型肝炎病毒株基因特征

目的分析2019年青岛市从3例有摩洛哥旅行史甲型肝炎(甲肝)病例中检测到的甲肝病毒(Hepatitis A virus,HAV)株基因特征和感染来源。方法对甲肝病例进行流行病学调查,采集急性期血清标本并提取HAV核酸,采用巢式RT-PCR扩增和/或拼接HAV VP1-2A区和近全基因组核苷酸序列并构建系统进化树,分析本研究HAV与GenBank中参考株的核苷酸和氨基酸同源性以确定基因型,分析主要中和抗原表位关键氨基酸位点突变和基因重组。结果3例甲肝病例在发病潜伏期内有摩洛哥旅行史和半生食贝类海产品史,并检测到HAV核酸。3株HAV均位于系统进化树的ⅠA基因亚型欧洲分支,且在VP1-2A区与ⅠA亚型参考株的核苷酸和氨基酸差异分别仅为0.29%-7.45%和0.00%-2.59%;病例1感染的HAV与2018年爱尔兰分离株18IRL89195近全基因组的核苷酸序列同源性最高(98.41%),仅在编码区的3D区第80位(V/L)和第372位(K/R)氨基酸不同。病例2和病例3感染的HAV近全基因组序列完全相同,与2016年法国污水分离株G22-029的核苷酸和氨基酸同源性最高,分别为99.85%和100%。未发现3株HAV存在主要中和抗原表位关键氨基酸位点突变和基因重组。结论本研究HAV毒株属于ⅠA基因亚型,推测为境外感染且可能与半生食贝类海产品有关。

模拟水样中戊型肝炎病毒检测方法的比较

目的对模拟水样中戊型肝炎病毒(HEV)的检测方法进行比较, 为水中HEV的检测提供参考。方法自来水或蒸馏水模拟水样中人工污染HEV粪便悬液, 用正电荷滤膜-有机洗脱液洗脱法(方法1)进行前处理, 比较A、B和C三种核酸提取试剂盒提取效果;对模拟水样用方法1、方法2(正电荷滤膜-直接裂解法)、方法3(切向流超滤膜-无机洗脱液洗脱法)、方法4(切向流超滤膜-直接裂解法)进行前处理, A试剂盒进行核酸提取, Real time RT-PCR方法检测, 比较回收率;对模拟水样中不同浓度HEV回收率进行比较;比较自来水样中的抑制物对Real time RT-PCR的抑制作用;对不同批次自来水标本的HEV进行检测。结果试剂盒A核酸提取效果更好;方法1、2、3和4的回收率分别为7.31%、39.88%、6.85%和64.88%, 结果显示回收率具有统计学差异(F=114.069, P<0.001)。方法4添加高、中、低浓度HEV的回收率分别为65.26%、42.76%、32.79%。四种前处理方法抑制率均小于75%, 符合ISO(15216-2∶2019)要求。对20份自来水标本进行HEV检测, 结果均为阴性。结论本研究表明两种滤膜分别结合直接裂解法回收效果更好;方法4在小体积蒸馏水或自来水的HEV的检测中回收率较高, 但受水样体积、浊度等限制。对不同的水质及实验室条件可选择合适的方法进行检测。

大连市2020年甲型肝炎病毒流行株基因特征

目的分析大连市甲型肝炎(甲肝)病毒(Hepatitis A virus,HAV)流行株基因特征。方法采集大连市2020年部分甲肝病例急性期血清或粪便标本,提取HAV核酸,采用巢式RT-PCR扩增目的基因,构建HAV获得序列与GenBank中参考序列的系统进化树,分析HAV序列VP1-2A区核苷酸和氨基酸同源性,确定基因型。结果从甲肝病例标本中获得54条HAV序列,核苷酸、氨基酸同源性分别为97.15%-100%、98.13%-100%,属于ⅠA基因亚型。获得序列与中国内地序列中2014年辽宁省丹东市、2019-2020年山东省烟台市和威海市序列的核苷酸同源性最高,为98.42%-99.69%;与其他国家序列中日本、意大利HAV序列的核苷酸同源性最高,为99.07%-100%。在获得序列中,53条序列的氨基酸同源性为100%,1条序列与其存在2个氨基酸差异。结论大连市2020年HAV优势流行株为ⅠA基因亚型,甲肝可能具有多个传播链和相同感染来源。HAV基因型监测有助于HAV溯源和及时采取应对措施。

草莓中甲型肝炎病毒检测方法的比较

目的对草莓中甲型肝炎病毒(hepatitis A virus, HAV)检测的两种检测方法进行优化比较, 以选出最佳的检测方法, 用于草莓中甲肝病毒的检测。方法向已知阴性冷冻草莓标本表面接种不同浓度的HAV, 优化碱性洗脱-PEG浓缩法中的牛肉浸出粉的浓度以及选择最适核酸提取试剂盒, 优化直接裂解法中的最适裂解缓冲液体积, 对草莓标本进行处理, 采用实时荧光定量RT-PCR检测回收的病毒量, 应用SPSS26.0对数据进行统计分析, 并将优化后的两种方法用于实际标本的检测。结果优化后的碱性洗脱-PEG浓缩法的牛肉浸出粉浓度选择3%, 病毒核酸提取试剂盒选择试剂盒B。优化后的直接裂解法的裂解缓冲液体积选择6 ml。对碱性洗脱-PEG浓缩法、直接裂解法在添加HAV不同浓度水平进行比较, 两种方法的HAV病毒回收率分别为21.50±1.06%、5.82±0.01%, 结果表明差异具有统计学意义。同时对四个地区共60份草莓标本进行检测, 结果均为阴性。结论优化后的碱性洗脱-PEG浓缩法灵敏度更高, 更适用于草莓标本中HAV的检测。

牡蛎中戊型肝炎病毒检测方法的比较

目的对牡蛎中戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)检测方法进行比较,为牡蛎中HEV的检测提供技术参考。方法参考欧盟ISO/TS 15216-2∶2019,用蛋白酶K消化法对人工污染HEV粪便悬液的牡蛎消化腺标本进行前处理后,分别用四种核酸提取方法进行HEV RNA提取,通过Real time RT-PCR检测,比较HEV回收率;分别用蛋白酶K消化法、蛋白酶K消化+PEG沉淀法和蛋白酶K消化+PEG沉淀+氯仿抽提法对人工污染的牡蛎消化腺标本进行前处理,用最优核酸提取方法进行HEV RNA提取,通过Real time RT-PCR检测,比较三种前处理方法的HEV回收率和抑制率。将最优HEV检测方法应用于市售牡蛎标本检测。结果四种核酸提取方法的HEV回收率分别为1.37%,2.50%,4.24%和7.56%,差异有统计学意义(F=847.220,P<0.001);三种前处理方法的HEV回收率分别为6.02%,13.65%和21.17%,差异有统计学意义(F=16.800,P<0.001),蛋白酶K消化+PEG沉淀+氯仿抽提法回收率最高;三种方法的抑制率分别为13.38%,20.98%和8.66%,差异具有统计学意义(F=20.205,P<0.001),蛋白酶K消化+PEG沉淀+氯仿抽提法抑制率最低。在120份市售牡蛎标本中检出一份HEV RNA阳性标本。结论在对牡蛎标本进行HEV检测时,用蛋白酶K消化+PEG沉淀+氯仿抽提法进行前处理,能够提高牡蛎中HEV的回收率,更适用于牡蛎标本的前处理;不同厂家的病毒核酸提取方法的HEV回收率不同,开展检测前应比对筛选,择优使用。

数字RT-PCR与荧光定量RT-PCR法检测草莓中甲型肝炎病毒

目的建立甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)数字芯片式RT-PCR(dRT-PCR)方法并与real time RT-PCR(RT-qPCR)方法进行比较,选出适用于检测草莓中HAV的最佳方法。方法提取HAV疫苗RNA,优化dRT-PCR的反应条件,评价其特异性;碱性洗脱-PEG浓缩法对草莓标本进行前处理后提取核酸,同时采用dRT-PCR与RT-qPCR方法,检测纯水或草莓基质中HAV疫苗RNA的敏感性、抑制率;比较人工污染草莓中HAV的回收率,并应用于市售标本中的检测。结果确立了dRT-PCR反应的最适退火温度为60℃,最佳引物、探针浓度为0.4μmol/L、0.4μmol/L、0.2μmol/L,特异度良好;两种检测方法检测HAV疫苗RNA在纯水或草莓基质中的敏感性没有明显差异,dRT-PCR的抑制率较低。dRT-PCR与RT-qRCR在检测较高浓度HAV污染草莓标本时的回收率分别为12.90±0.006%、30.12±0.02%;在检测较低浓度HAV污染草莓标本时的回收率分别为18.27±0.07%、10.85±0.03%,差异均具有统计学意义(P<0.05)。对市售标本进行检测,两种方法检测结果均为阴性。结论本研究建立的dRT-PCR法,与RT-qPCR检测不同基质中的HAV RNA敏感性没有明显差异,但dRT-PCR对PCR反应抑制物有较好的耐受能力,在检测低浓度HAV时回收率较高。两种检测方法均可用于草莓中甲型肝炎病毒的定量检测,可根据具体实际情况进行选择。

从噬菌体抗体库筛选获得中和性人源抗甲型肝炎病毒Fab抗体

目的 研制人源抗甲型肝炎病毒基因工程抗体 ,为预防甲型肝炎病毒感染提供有效的方法。方法 采用噬菌体表面展示技术 ,从一名甲型肝炎恢复期病人的抗凝血中分离淋巴细胞 ,提取总RNA逆转录后 ,用一组人IgGFab特异性引物扩增。 结果 克隆和表达了 8株人源抗甲型肝炎病毒抗体Fab段基因 ,经ELISA检测为特异性人抗甲型肝炎病毒Fab段抗体。结论 该 8株人源抗甲型肝炎病毒Fab抗体都能与具有中和活性的鼠抗甲型肝炎病毒单克隆抗体产生竞争抑制反应 ,选其中的 2株做体外中和实验 。

抗甲肝病毒人源基因工程全抗体分子在杆状病毒中的表达

目的 探讨人源抗甲型肝炎病毒全抗体分子在杆状病毒中的表达。方法 将获得的人源抗甲肝病毒中和性抗体Fab段基因克隆入含信号肽及Fc的杆状病毒表达载体中并在杆状病毒细胞中表达。结果 获得了中和性人源抗甲肝病毒全抗体分子的表达产物并进行了纯化 ,轻重链表达产物位置大小正确 ,HAFc16抗体能与具有中和活性的鼠抗甲肝病毒单克隆抗体产生竞争抑制反应 ,并能在体外中和甲肝病毒 ,另一株HAFc78抗体同样具有体外中和甲肝病毒的活性 ,但系抗不同位点的抗体。结论 获得的人源抗甲肝病毒全抗体分子表达产物具有很好的体外中和甲肝病毒的活性 ,且为抗不同位点的抗体 ,为这些抗体的进一步开发及应用打下了基础 ,为防止甲型肝炎暴发流行提供应急措施。

合成肽抗原抗丙型肝炎病毒ELISA诊断方法的研究

用人工合成的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）结构区寡肽Ｃｐ－１９及非结构区寡肽ＮＳ４－２１组装成抗－ＨＣＶＥＬＩＳＡ试剂。经中国药品生物制品检定所抗－ＨＣＶ标准系列血清验证二次。第一次参比血清组结果与预期结果完全相符，第二次参比血清组除１份弱阳性标本漏检外，其余也完全相符，但检测血清的稀释度较标准稀释度低。试剂重复性好，在１８～２０℃放置７天，４℃放置３个月，仍保持原活性。试剂与国内合成肽抗－ＨＣＶＥＬＩＳＡ试剂水平相当，可供临床检测之用。

用噬菌体展示肽库技术筛选甲肝病毒抗原模拟表位

目的用噬菌体展示肽库技术筛选甲型肝炎（甲肝）病毒抗原模拟表位，为病毒抗原决定簇定位探索可行方法。方法用纯化的抗甲肝病毒单克隆抗体，对噬菌体展示12肽库进行3轮“吸附一洗脱一扩增”筛选，随机挑取10个克隆，用酶联免疫吸附法（ELISA）对噬菌体克隆进行抗原性鉴定、竞争抑制鉴定及DNA序列测定分析，推导出展示肽氨基酸序列并与甲肝病毒（HAV）代表株结构蛋白氨基酸序列比较。结果lO个噬菌体克隆ELISA检测全为阳性，9个具有一致序列，与HAVHMl75株结构蛋白中和活性表位之一：VPl157—171区具有类似序列，另一株噬菌体克隆在HAVHMl75中未发现类似序列，结果表明这些展示肽可能是HAV抗原模拟表位。结论用噬菌体展示肽库技术筛选得到了HAV模拟表位，为开展病毒模拟表位研究打下了基础。

国产甲型肝炎病毒总抗体检测试剂的评价

目的比较国内常用抗甲型肝炎(甲肝)病毒总抗体(Total Antibody to Hepatitis A Virus,Anti-HAV)酶免疫测定(Enzyme Immunoassay,EIA)试剂的性能,为甲肝血清流行病学调查试剂的选择提供参考。方法以雅培(Abbott)HAVAb2.0试剂的检测结果作为金标准,确定参比系统的总Anti-HAV含量。用A、B两种国产总Anti-HAVEIA试剂,平行检测参比系统8遍,记录CO/S值并作ln(CO/S+0.1)转换,通过广义线性化估计方程(Generalized Estimating Equation,GEE)模型估计各次测试样本的阳性概率,计算比较两种试剂的可靠性指标和真实性指标:组内相关系数(Intraclass Correlation Coefficient,ICC)、变异系数(Coefficient of Variability,CV)和全部受试者工作特征(Receive Operation Characteristic,ROC)曲线下面积和部分ROC曲线下面积,以及固定特异度下的灵敏度[Sensitivityata Particular False-Positive-Rate(1-Specificity),Se(FPR=e)],对比阐明两者之优劣。结果 A试剂的ICC和CV分别为0.9971和5.7840%,B试剂的为0.9952和6.2931%(Bootstrap法,P<0.05);A试剂的ROC曲线下面积(Areaunder Curve,AUC)和部分(Partial)ROC曲线(特异度为0.9～1)下面积(pAUC)分别为0.9557和0.0717,B试制的为0.9404和0.0663(Bootstrap法,P<0.05);在特异度为0.920～0.970时,间隔0.005计算的Se(FPR=e),在特异度为0.945、0.950、0.955、0.960几个观察点时,A试剂的灵敏度>B试剂(Bootstrap法,P<0.05);而在特异度为其他观察点时,对应灵敏度的差异尚无统计学意义(Bootstrap法,P>0.05)。结论 A、B两种试剂均表现出良好的诊断能力,虽然某些指标的差异有统计学意义,但差异有无实际意义,值得进一步探讨。在实际应用时,可根据具体情况进行选择。

中国部分地区猪胆汁戊型肝炎病毒基因型和中和抗原位点变异研究

目的调查猪胆汁戊型肝炎病毒(HEV)携带率、基因型和中和抗原位点变异。方法在中国4个地区屠宰场采集成年商品猪的胆汁标本,采用real-time RT-PCR检测HEV RNA;采用巢式RT-PCR扩增HEV ORF2区部分基因片段,进行基因分型和中和抗原位点氨基酸序列分析。结果猪胆汁标本HEV RNA总阳性率为8.6%(46/532),4个地区阳性率在3.0%-12.5%之间。19株HEV基因分型成功,均为基因4型,其中11株HEV基因亚型分型成功,均为4a亚型。在该11株HEV的21个中和抗原位点中,2株HEV在ORF2区分别发生第487位氨基酸突变(Ser487Tyr)和第564位氨基酸突变(Thr564Pro)。结论中国部分地区猪胆汁HEV携带率较高,为中国人群中优势流行的基因4型,且部分中和抗原位点发生突变;应加强猪群HEV的持续监测。