基于动态平衡失调理论治疗菱形肌损伤

目的 基于动态平衡失调理论应用以小针刀为主、中药内服为辅的方法治疗菱形肌损伤并对比观察治疗效果及炎症指标变化。方法 将2018年10月至2020年10月就诊我院中医科、康复科、骨科门诊并住院的71例菱形肌损伤患者分为对照组(小针刀组)、观察组(小针刀加中药内服组),治疗5 d后对患者进行中医症状疗效判定、疼痛缓解的视觉模拟评分法(VAP)评定,治疗前及治疗5 d后对患者进行数字疼痛评分法(NPRS)评定、测定血清5-羟色胺(5-HT)和前列腺素E2(PGE2)水平。结果 观察组中医症状疗效优于对照组(P <0.05)。治疗前,两组患者NPRS评分、血清5-HT、血清PGE2差异无统计学意义(P> 0.05);治疗后,观察组NPRS评分优于对照组,观察组血清5-HT、血清PGE2均低于对照组(均P <0.05)。结论 基于动态平衡失调理论应用小针刀配合中药内服治疗菱形肌损伤疗效确切,比单独应用小针刀治疗效果好。

BPIFC基因真核表达载体的构建

目的构建带有FLAG标签的BPIFC基因真核表达载体,建立稳定转染BPIFC基因的HaCaT细胞系。方法设计引物通过PCR扩增出BPIFC基因片段,利用DNA重组技术将该基因片段定向插入pcDNA3.1-flag-N真核表达载体中,并对重组质粒进行双酶切及DNA测序鉴定。验证正确的重组质粒通过PI Max线性转染的方法转染至HaCaT细胞,通过G418筛选建立BPIFC稳定转染的HaCaT细胞系,并通过RT-PCR法和Western-blot法分别测定BPIFC mRNA和蛋白的表达量。结果双酶切和DNA测序结果表明,pcDNA3.1-BPIFC真核表达质粒构建成功。RT-PCR结果表明,重组质粒的mRNA表达量高于空载转染组和空白对照组;Western-blot结果显示,BPIFC融合蛋白在HaCaT细胞中成功表达。结论成功建立BPIFC稳定转染的HaCaT细胞系,可表达带有FLAG亲和标签的BPIFC蛋白用于后续实验研究。

miR-205通过下调ZEB1和ZEB2表达抑制肾小管上皮细胞转分化

目的探讨miR-205在肾小管上皮细胞转分化的作用机制。方法将miR-205 mimics和scrambled control分别转染HK-2转分化细胞株,采用real-time q PCR检测miR-205和ZEB1、E-cadherin、α-SMA mRNA的表达水平;运用Western blotting检测ZEB1、ZEB2、E-cadherin、α-SMA的表达水平。通过细胞免疫组化检测β-catenin的异位表达情况和E-cadherin的表达情况。结果miR-205 mimics转染HK-2转分化细胞株后,ZEB1和ZEB2的表达水平较高糖组得到大幅下调(P<0.01),而E-cadherin的表达水平较高糖组显著提高(P<0.01),同时间质细胞特征分子α-SMA的表达水平显著降低(P<0.01)。miR-205 mimics也显著抑制了HK-2转分化过程中β-catenin异位表达,在维持上皮细胞的形态方面也起着重要的作用。结论 miR-205可通过下调ZEB1和ZEB2的表达,抑制了肾小管上皮间质转分化进程。

丹参酮ⅡA对高糖诱导肾小管上皮细胞转分化中Wnt/β-catenin信号途径的影响

目的探究高糖诱导肾小管上皮细胞转分化过程中Wnt/β-catenin信号途径的表达及丹参酮ⅡA对其影响。方法将人近端肾小管上皮细胞(HK-2),分为正常糖组(NG组)、高糖组(HG组)、高糖+丹参酮ⅡA干预组(HG+T组)。采用免疫细胞化学观察β-catenin表达情况;Western印迹检测β-catenin、上皮细胞标志性蛋白E-钙粘蛋白(E-cadherin)、间充质细胞标志性蛋白α-SMA的表达;RT-PCR检测β-cate-nin、E-cadherin mRNA表达水平。结果与NG组比较,HG组β-catenin蛋白及mRNA表达显著增强(P<0.01),E-cadherin表达显著降低(P<0.01),β-catenin蛋白在胞浆与胞核表达增强。终浓度为100μmol/L的丹参酮ⅡA可显著减少β-catenin的异位表达;在该浓度下,β-catenin在胞核蛋白及mRNA的表达量显著下降,而E-cadherin蛋白及mRNA的表达水平上升,同时间充质细胞标志性蛋白α-SMA的表达明显下降。结论 Wnt/β-catenin信号途径参与了高糖诱导肾小管上皮细胞转分化过程,丹参酮ⅡA可能通过下调Wnt/β-catenin信号途径的活性而抑制转分化过程,进而发挥保护肾脏的作用。

HLA-B27基因亚型分型检测

目的对HLA-B27阳性的样本进行分型检测,探讨HLA-B27亚型分布情况。方法采用HLA-B27SSP(序列特异引物聚合酶链反应)亚型分型试剂盒,对流式细胞仪及B27基因筛查为阳性的样本进行分型检测。结果 91个流式细胞仪及PCR-SSP筛查均为阳性样本中,88例为B2704/25,占96.70%;1例为B2705,占1.10%;2例表现为HLA-B27阳性,但型别未确定,占2.20%。结论本实验检测的HLA-B27阳性样本型别以B2704/25为主。

序列特异引物聚合酶链反应在HLA-B27检测中的应用

目的探讨序列特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP)方法在人类白细胞抗原B27检测中的应用。方法对经流式细胞术分析定型的279例疑似强直性脊柱炎患者样本采用PCR-SSP法检测HLA-B27的表达。以流式细胞术检测结果为判断标准,对结果不一致样本,进一步应用PCR-直接测序法进行B27测序分析。结果与流式细胞术结果相比,只有1例结果不一致。经测序分析,其碱基序列与PCR-SSP法特异性引物3′末端错配;且发现该样本序列存在多个杂合碱基,经与HLA-B27等位基因数据库比对,该杂合序列与最相近B*2733亚型存在2个碱基差异。结论 PCR-SSP法可适用于HLA-B27的临床检测。

Cre/loxP系统介导删除酿酒酵母ALD_4基因研究

设计与酿酒酵母编码乙醛脱氢酶ALD4基因ORF两侧序列同源的删除组件引物,以质粒pUG6为模板进行PCR构建带有Kanr选择标记的删除组件。通过醋酸锂转化法将删除组件导入酿酒酵母菌,采用G418筛选阳性克隆子,将质粒pSH65转入阳性克隆子。半乳糖诱导pSH65表达Cre酶切除Kanr基因,在ALD4基因ORF处留下1个loxP位点,通过2次的转化筛选验证获得ALD4双倍体基因缺陷型突变株Y01-ALD4。

MiR-4258靶向调控CDH19对膀胱癌T24细胞分化和侵袭能力的影响

目的 探讨miR-4258在膀胱癌T24细胞分化和侵袭过程中的作用机制。方法 通过TargetScan和荧光素酶报告基因验证miR-4248靶基因。将T24细胞分为正常对照NG组、阴性对照miR-ctrl组、miR-4258inhibitor组和miR-4258mimics组,采用脂质体(Lipo 2000)细胞转染法转染;采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time qPCR)检测组织和细胞的miR-4258表达水平;运用免疫印迹(Western blot)检测Cadherin-19(CDH19)、E-cadherin、α-SMA的表达水平。通过Transwell检测侵袭能力的变化,明胶酶谱法测定基质金属蛋白酶2(MMP2)的活性。结果 miR-4258在膀胱上皮癌组织中的表达水平明显高于其癌旁组织,差异有统计学意义(t=3.711,P<0.01);生物信息学预测和荧光素酶报告基因验证miR-4258作用靶点为CDH19 3′UTR。miR-4258mimics转染T24细胞后,CDH19和上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)的蛋白表达水平较miR-ctrl组显著下调(P<0.05),而α-SMA的表达水平较miR-ctrl组显著提高(P<0.01);上调miR-4258表达MMP2的活性较miR-ctrl组显著提高(P<0.01),同时T24细胞的侵袭能力也得以明显增强。结论 miR-4258调控靶点为CDH19,可能通过下调CDH19的表达水平,促进了T24细胞分化,增强了T24的迁移和侵袭能力。

黄绿青霉素对神经细胞PC-12损伤作用的研究

目的研究黄绿青霉素(CIT)诱导神经细胞PC-12的损伤作用。方法CIT处理组分为三组,终浓度分别为2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L,设DMSO为空白对照组。药物处理细胞24h后,观察细胞形态的变化,CCK-8法测细胞活性,流式细胞仪测ROS荧光值;取细胞培养液测LDH释放率、NO含量及MDA;细胞裂解液检测GSH含量及SOD活力。结果PC-12与CIT共培养后,细胞成团,出现空斑。与对照组比较,CIT组的细胞活力显著降低(P<0.01),LDH释放率显著升高(P<0.01);NO含量明显下降(P<0.05),呈剂量效应关系;氧化应激相关指标MDA含量显著升高(P<0.01);ROS含量在低、中、高剂量组中均显著升高(P<0.01,P<0.01,P<0.05);GSH含量呈下降趋势,10μmol/L组效果显著(P<0.05);SOD活力显著升高(P<0.01)。结论黄绿青霉素对神经细胞PC-12有明显的损伤作用,可能与氧化应激机制有关。

组织内PGK1、SOCS1、LAG-3水平与子宫内膜癌病理特征的相关性分析

目的 研究组织内磷酸甘油酸酯激酶1(PGK1)、细胞因子信号传导抑制因子1(SOCS1)、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)水平与子宫内膜癌病理特征的相关性。方法 回顾性选取2017年3月至2019年3月宁德师范学院附属宁德市医院收治的98例子宫内膜癌患者,所有患者均行手术治疗,分别取癌组织、癌旁组织各2块。行免疫组织化学检查PGK1、SOCS1、LAG-3表达情况。比较癌组织及癌旁正常组织中PGK1高表达占比及SOCS1、LAG-3的阳性检出率;观察不同临床病理特征子宫内膜癌患者PGK1高表达占比及SOCS1、LAG-3的阳性检出率表达情况。最后对98例患者行3年院外随访,观察癌组织PGK1高、低表达及SOCS1、LAG-3阳性、阴性患者术后3年存活率差异。结果 癌组织内PGK1高表达占比及LAG-3阳性检出率为39.80%、62.24%,显著高于癌旁正常组织(8.16%、13.27%),SOCS1阳性检出率为22.45%,显著低于癌旁正常组织(58.16%),差异均有统计学意义(P<0.05)。不同年龄、肿瘤直径、病理类型患者的PGK1高表达占比及SOCS1、LAG-3阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05);FIGO分期为Ⅲ~Ⅳ期、分化程度低分化、浸润深度≥1/2、淋巴结转移患者的PGK1高表达占比及LAG-3阳性检出率较高,SOCS1阳性检出率显著较低,差异均有统计学意义(P<0.05)。98例行根治性手术患者均获得3年院外随访,3年病死率25.51%(25/98),存活率74.49%(73/98);Kaplan-Meier生存分析显示癌组织PGK1表达越高患者存活率越低(P<0.05);Kaplan-Meier生存分析显示癌组织SOCS1阳性检出率越高患者存活率越高(P<0.05);Kaplan-Meier生存分析显示癌组织LAG-3阳性率越高患者存活率越低(P<0.05)。结论 子宫内膜癌患者癌组织内PGK1、SOCS1、LAG-3与疾病的进展关系密切,且癌组织PGK1高表达及SOCS1、LAG-3阳性检高均会影响患者预后。

小檗碱对乌拉坦诱导的肺癌模型小鼠PI3K/AKT信号通路的作用研究

目的:探究小檗碱对乌拉坦诱导的肺癌模型小鼠的保护作用及对PI3K/AKT信号通路的调控作用。方法:将120只小鼠随机分为空白组,模型组,顺铂组和小檗碱高、中、低剂量组,每组20只。除空白组外,其他小鼠腹腔注射乌拉坦建立肺癌模型。空白组和模型组小鼠灌胃等量生理盐水;顺铂组和小檗碱高、中、低剂量组小鼠予以药物干预。实验期间记录小鼠的体质量、自主活动,计算肺癌发生率和肺肿瘤结节数,HE染色观察肺组织病理变化,ELISA试剂盒检测血清CEA、CA125含量,免疫组化检测肺组织EMT转化标志E-cadherin、N-cadherin蛋白阳性细胞百分比,Western blotting法检测肺组织PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组小鼠的生存质量较差,肺癌发生率为100%,肺组织出现明显癌变,血清中CEA和CA125的含量增加,肺组织E-cadherin蛋白表达降低,N-cadherin蛋白表达增加,PI3K、AKT、p-AKT蛋白相对表达量增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,小檗碱可改善小鼠的生存质量,降低肺癌发生率和肺肿瘤结节数,肺组织形态显著改善,炎症细胞浸润减轻,血清CEA和CA125的含量降低,肺组织E-cadherin蛋白表达增加,N-cadherin蛋白表达降低,PI3K、AKT、p-AKT蛋白相对表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05),且呈剂量依赖性(P<0.05)。其中,小檗碱高剂量组各指标与顺铂组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:小檗碱对乌拉坦诱导的小鼠肺癌具有保护和改善作用,其机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路的活化有关。

荧光定量PCR染料法在HLA-B27检测中的应用

目的探讨荧光定量PCR染料法检测HLA-B27基因对于诊断强直性脊柱炎的临床应用价值。方法应用流式细胞术和荧光定量PCR技术对强直性脊柱炎疑似患者170例进行HLA-B27基因及其亚型检测,对结果不一致样本,进一步应用PCR-直接测序法进行B27测序分析。结果两种方法检测符合率为92.9%,差异无统计学意义(P>0.05);5例结果不一致样本为流式细胞分析阳性,而荧光定量PCR法和PCR-直接测序分析为B*40亚型或B*40与B*58的杂合型;在158例AS相关患者中,共检出3种HLA-B27等位基因:B*2704为主要亚型,占96.8%,其次为B*2705,占1.9%,另有2例为B*2706,占1.3%,结论荧光定量PCR染料法可有效提高HLAB27检测的准确性,并能够实现HLA-B27亚型分析,可为深入探讨HLA-B27在AS中发病中的作用提供依据。

波动性高糖对肾小管上皮细胞Wnt/β-catenin信号途径的影响

肾脏纤维化分为肾小球硬化和肾小管间质纤维化（tubular interstitial fibrosis，TIF），而TIF过程与肾损伤具有密切的关系。TIF是由于细胞外基质的过度沉积造成的，肌成纤维细胞是TIF发生发展过程中产生细胞外基质的主要细胞，该过程被成纤维细胞激活，涉及上皮细胞向肌成纤维细胞的转分化^[1-2]。Wnt／β-catenin信号途径涉及细胞增殖、肿瘤发生与转移的调控。β-catenin是Wnt信号途径的关键分子，在细胞的生长与分化过程中起着重要的作用，

波动高糖诱导肾小管上皮细胞转分化差异表达miRNAs分析

采用miRCURY基因芯片(v.16.0)分析波动高糖诱导肾小管上皮细胞转分化(epitheli-al-messenchymal transition,EMT)差异表达miRNAs,设定平均上升或下降倍数大于2倍和P<0.05为差异标准。结果发现,基因芯片分析中49个miRNAs表达显著上调,其中6个基因已证实在肾纤维化过程中表达升高;34个miRNAs表达显著下调,其中8个已报道在肾纤维化中表达降低。通过荧光定量PCR(RT-qPCR)验证,结果显示,基因芯片与RT-qPCR两方法分析的结果呈高度相关(r=0.98,P<0.01)。miRNAs差异表达与波动高糖诱导肾小管上皮细胞转分化过程密切相关,且基因芯片与RT-qPCR结果一致,以期为肾纤维化早期诊断与治疗提供新的靶点。

慢病毒介导miR-4258-siRNA表达对波动高糖诱导肾小管上皮细胞转分化的影响

该实验构建了慢病毒介导(lentivirus,LV)的miR-4258-siRNA,探讨干扰miR-4258对肾小管上皮细胞(HK-2)转分化的影响。将HK-2转分化细胞分为正常组、阴性对照组和干扰组;荧光定量PCR方法检测miR-4258的表达情况;免疫印迹检测Fibronectin、E-cadherin和α-SMA的表达情况。结果显示,miR-4258-siRNA-LV可显著降低miR-4258的表达水平,干扰组的Fibronectin和α-SMA的相对表达量较阴性对照组显著下调;而E-cadherin的相对表达量较阴性对照组明显上调。研究说明,通过慢病毒介导的miR-4258-siRNA-LV下调miR-4258的表达,可抑制波动高糖诱导的HK-2细胞转分化过程。

温肾健脾活血固精方治疗系膜增殖性肾炎临床研究

目的:观察温肾健脾活血固精方治疗脾肾阳虚夹血瘀型系膜增殖性肾炎的临床疗效。方法:将60例脾肾阳虚夹血瘀型系膜增殖性肾炎患者分为治疗组和对照组。治疗组30例,以温肾健脾活血固精方为基本方加西药治疗;对照组30例,单纯予以西药治疗。观察两组患者治疗前后临床症状、体征、细胞免疫、体液免疫、血β-微球蛋白(βmicroglobulin,β-MG)、24 h尿蛋白定量变化情况,判定临床疗效。结果:治疗组患者临床症状、体征和免疫功能改善情况均优于对照组(P<0.05),且患者血β-MG、24 h尿蛋白定量较对照组明显降低(P<0.05);治疗组有效率为86.7%,显著高于对照组的60.0%,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:温肾健脾活血固精方对脾肾阳虚夹血瘀型系膜增殖性肾炎有较好的临床疗效。

产前诊断9号染色体三体嵌合体病例的遗传学分析

目的探讨胎儿9号染色体三体嵌合体病例的遗传学诊断方法。方法通过羊水细胞SNP-array、CNV-seq技术、羊水细胞间期FISH对9号染色体三体嵌合比例及遗传病因检测。结果羊水细胞核型分析为:47,X?,+9[64]/46,X?[36],SNP-array分析显示胎儿约40%细胞为9号染色体三体,同时显示胎儿的9号染色体为来自父母一方的单亲二体性(UPD)。羊水细胞间期FISH显示9号染色体三体嵌合比例为36%,胎儿皮肤组织嵌合比例为30%,胎盘组织嵌合比例为85%,超声显示(21 W 3 d):胎儿侧脑室双侧宽度为0.89 cm。结论胎盘组织发生了更为广泛的变异,9号染色体三体嵌合可能与侧脑室增宽相关。通过未经培养的羊水细胞行SNP-array或CNV-seq进行产前诊断,可避免细胞优势生长所造成的误差,为遗传咨询提供可靠的依据。

腰椎间盘突出症血清TNF-α、MMP-2表达水平及其与中医证型的关系

目的观察腰椎间盘突出症血清肿瘤坏死因子(TNF-α)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达水平及其与中医证型的关系。方法选取本院收治的120例腰椎间盘突出症患者,根据中医辨证分型分为气滞血瘀组与肝肾亏虚组各60例,采用酶联免疫法检测两组血清TNF-α、MMP-2表达水平,分析不同中医证型腰椎间盘突出症患者血清TNF-α、MMP-2的表达差异。结果治疗后,气滞血瘀组患者血清TNF-α、MMP-2水平显著低于肝肾亏虚组患者(P<0.05);气滞血瘀组患者腰痛视觉模拟评分(VAS)和Oswestry功能障碍指数(ODI)评分均低于肝肾亏虚组患者(P<0.05);Pearson相关系分析结果显示,腰椎间盘突出症患者血清TNF-α水平与VAS、ODI评分呈正相关;腰椎间盘突出症患者血清MMP-2水平与VAS、ODI评分呈正相关,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论气滞血瘀型腰椎间盘突出症患者与肝肾亏虚型患者相比,血清TNF-α水平更高、MMP-2水平更低,二者与VAS、ODI评分有相关性,可作为中医辨证的辅助指标。

重组人表皮生长因子对受损人子宫内膜间质细胞的修复作用研究

目的研究重组人表皮生长因子(rhEGF)对受损人子宫内膜间质细胞(ESCs)的修复作用,为子宫内膜损伤的临床治疗提供新思路。方法2018年6月至2020年8月在宁德师范学院附属宁德市医院完成试验。选择手术切除的子宫内膜,用1%Ⅰ型胶原酶消化过滤后,分离纯化ESCs,用免疫荧光法鉴定细胞。采用不同浓度米非司酮损伤ESCs,以正常细胞为对照组;设置不同损伤时间,用MTS法检测细胞活性,确定最佳的损伤浓度和时间。用不同浓度的rhEGF与受损的ESCs共培养24h,检测细胞活性,明确rhEGF对受损的ESCs是否有修复作用。通过划痕实验,观察24h细胞迁移情况,计算愈合比,验证rhEGF对受损的ESCs迁移能力的影响。结果ESCs分离24h即可贴壁,刚开始呈三角形,单个分布,随后生长成为呈现有成纤维细胞形态的梭形细胞,通过鉴定间质细胞的纯度可达95%以上。米非司酮对ESCs的损伤呈时间-剂量效应,作用时间超过48h,ESCs活性急剧下降(P<0.05),选择48h作为最适损伤时间。米非司酮浓度超过60μmol/L时,ESCs活性显著下降(P<0.05),选择60μmol/L作为损伤最适浓度。rhEGF与受损的ESCs共培养24h,高剂量rhEGF能够显著提高损伤ESCs活性(P<0.05)。划痕实验中,细胞迁移速度随rhEGF剂量增大而提高,100μg/L rhEGF以上的剂量组愈合比具有统计学意义(P<0.05)。结论rhEGF与米非司酮损伤的ESCs共培养后,细胞活性和迁移能力能够显著提高,rhEGF对其具有明显的修复作用。