褪黑素对卵巢摘除大鼠体内炎症状态及BMSCs成骨能力影响的研究

目的探讨褪黑素(melatonin,MT)对卵巢摘除(ovariectomy,OVX)大鼠骨量、血清炎症因子水平和对脂多糖刺激下BMSCs培养液中炎症因子水平和成骨能力的影响。方法将15只12周龄SD大鼠随机分为3组,假手术组大鼠仅接受双侧侧腹部切开缝合,OVX组行双侧OVX,OVX+MT组在双侧OVX术后行100 mg/(kg·d)MT口服干预。8周后采用ELISA法检测大鼠血液样本中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平;用Micro-CT检测股骨远端,观察骨量及骨微结构变化并对骨体积分数、骨小梁厚度和骨小梁数量进行定量检测。取3只3周龄SD大鼠,采用全骨髓培养法提取股骨骨髓中的BMSCs并传代培养。经鉴定后取第3~5代细胞,用不同浓度(0、1、10、100、1000μmol/L)MT干预并行细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测细胞活力,筛选最佳浓度MT用于后续实验。将细胞分为成骨诱导组(A组)及成骨诱导+1/5/10μg/mL脂多糖组(B~D组),进行相应干预后用ELISA法检测细胞培养液中IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平;根据CCK-8法和ELISA检测结果,用刺激炎症效果最显著浓度的脂多糖以及最佳药物浓度的MT加成骨诱导培养基对细胞进行干预,并设为E组,同样采用ELISA法检测各炎症因子表达水平;之后分别对A、D、E组行ALP染色和茜素红染色,并用实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)法检测成骨相关基因Ⅰ型胶原α1链(collagen typeⅠalpha 1 chain,Col1a1)、RUNX家族转录因子2(RUNX family transcription factor 2,Runx2)表达水平。结果ELISA和Micro-CT检测示,与假手术组比较,OVX组大鼠骨量减少,血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平升高(P<0.05);经MT治疗后,OVX+MT组上述指标均得到改善(P<0.05)。成功提取大鼠BMSCs,CCK-8法检测示100μmol/L是不影响细胞活性的最大MT浓度,将其用于后续实验。ELISA检测示,加入脂多糖刺激后,B~D组细胞培养液中的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平明显升高,与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05);并且呈浓度依赖性,D组各炎症因子表达水平明显高于B、C组(P<0.05);E组加入MT干预后,各炎症因子表达水平较D组显著降低(P<0.05)。ALP染色、茜素红染色及RT-qPCR检测示,与A组比较,D组ALP和茜素红阳性面积百分比以及Col1a1、Runx2 mRNA相对表达量均显著降低,经MT干预后E组上述指标均显著提升,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论MT可能通过降低大鼠体内炎症对绝经后骨质疏松症的骨量产生影响;MT能降低脂多糖刺激引起的BMSCs炎症,并减弱其对BMSCs成骨分化的抑制。