金鱼Caspase-8多克隆抗体的制备

为研究环境压力对金鱼细胞凋亡外在途径的影响,设计特异性引物扩增Caspase-8基因片段(编码第305—763位氨基酸),然后进行原核表达,并通过动物免疫实验制备Caspase-8多克隆抗体,检测其效价、金鱼不同组织表达水平和相关蛋白互作.结果表明:制备的Caspase-8多克隆抗体与抗原结合的最大稀释倍数为1∶256 000,显示出良好的免疫原性;Caspase-8在金鱼不同组织中有不同程度表达;Caspase-8与E3泛素连接酶cullin3存在相互作用.综上,制备的Caspase-8多克隆抗体有望应用于金鱼细胞凋亡蛋白Caspase-8表达水平及相关蛋白互作的研究中.

青海湖裸鲤类胰岛素生长因子IGF-Ⅱ的原核表达

青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)俗称湟鱼,属鲤科裂腹鱼亚科裸鲤属,是我国最大内陆咸水湖青海湖中唯一的经济鱼类,其生长极其缓慢,平均每生长到500g需要近10年[1]。青海湖裸鲤具有明显的生殖洄游。

不同产地佛手水溶性多糖的分离纯化及初步分析

醇提后的佛手经热水提取并除去蛋白质,乙醇沉淀得到粗多糖.用DEAE葡聚糖A-50离子交换色谱分离得到不同的多糖:金佛手和建佛手各分离得到3种多糖,川佛手分离得到4种多糖.将佛手多糖经酸水解后用硅胶G薄层色谱分析,金佛手多糖和建佛手多糖各检测到3种单糖成分:甘露糖、葡萄糖和半乳糖,川佛手多糖检测到5种单糖成分:鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖.红外光谱分析表明,3种产地佛手多糖的吸收光谱均具有典型的吡喃糖特征吸收峰;同时,金佛手多糖还具有较强的呋喃环特征吸收峰.

一种含铜SOD模拟化合物在植物生长调节中的作用

为了探讨超氧化物歧化酶SOD模拟化合物Lz35 9在植物生长调节中的作用 ,比较了不同植物组织经Lz35 9处理后在形态及生化指标上的变化 .通过金鱼草组织培养 ,证明Lz35 9具有过膜性 ,并有可能改变植物组织内源激素的平衡 ;观察到经Lz35 9叶面喷雾后冬小麦返青期长势改善 ,在不同生长时期 ,叶片SOD酶的活力较对照组均有一定程度的提高 .实验表明Lz35 9可间接促进孕穗期冬小麦叶片过氧化氢酶CAT酶活性的提高 ,但对过氧化物酶POD似乎影响不大 .用Lz35 9溶液对金鱼草进行插花处理 ,对不同衰老程度的花瓣均有明显的促SOD酶活性的作用 ,其中又以处于生长中期的组织效果最为明显 .

佛手GRAS基因的克隆及表达分析

利用抑制消减杂交法从芸香科柑橘属不耐寒植物佛手中分离得到了一个表达序列标签(EST)片段,结合RACE技术克隆获得该基因的1 669 bp序列,编码区长1 236 bp,编码413个氨基酸.通过Blastn同源序列比对分析,结果显示该基因与拟南芥已知的GRAS基因同源性较高;与GenBank数据库比对分析,表明该基因具有GRAS特有的保守结构域.因此,命名该基因为:CmsGRAS(GenBank登录号:JF440647).用荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)的方法研究了该基因在低温胁迫处理下的表达特性,结果显示该基因在低温胁迫后的表达量有明显的变化.

佛手低温胁迫相关基因的差异表达

佛手(Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle)是药用及观赏价值都很高的经济植物,但它对低温反应敏感,容易发生冻害现象。因此,了解其冷敏感机制对提高抗寒性起着重要的作用。以佛手为试材,-4℃低温处理24 h后,采用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)和半定量RT-PCR技术,分析和鉴定与冷敏感相关的差异表达基因。DDRT结果获得差异片段121个,经生物信息学分析,差异表达序列中有33条为功能已知序列,88条为未知序列(其中5条具有开放性阅读框);半定量结果获得34个阳性基因片段,其中上调基因片段29个,下调基因片段5个。除了3个基因功能未知外,其余基因主要涉及植物防御/应激反应,细胞壁的修饰,信号转导,代谢,氨基酸转运,氧化损伤,转录和蛋白质的合成,其中与植物防御/应激反应和光合作用有关的基因可能是造成佛手寒敏感的主要原因。

佛手氨基酸及多糖含量的测定

为了测定佛手中氨基酸及多糖的含量 ,采用微量凯氏定氮法测定粗蛋白 ,氨基酸自动分析仪测定氨基酸 ;用柱层析法分离、纯化多糖 ,电泳鉴定其纯度 ,苯酚 硫酸法比色测定多糖的含量 .结果表明佛手中w(粗蛋白 )为 9.375 %,w(氨基酸 )为 8.334 %,含 16种氨基酸 ,其中人体必需的氨基酸有 6种 ;佛手水提取液经分离、纯化 ,得到 3种多糖 ,经电泳鉴定为单一多糖 ,命名为JFS Ⅰ、JFS Ⅱ和JFS Ⅲ ,苯酚 硫酸比色法测得 3种多糖的质量分数分别为 41.2 %、9.8%和 2 1.4%.说明佛手具有较为丰富的氨基酸和多糖 ,提示有较高的营养价值和药用价值 .

不同砧木对甜樱桃抗涝性影响

[目的]为筛选耐涝的甜樱桃嫁接砧木提供科学依据。[方法]以甜樱桃早大果为接穗,研究5种砧木(考特、本溪山樱、大青叶、尖嘴红樱和莱阳矮樱)嫁接苗的涝胁迫光合生理特性及抗性生理,利用隶属函数法对5种砧木甜樱桃抗涝性进行综合评价。[结果]随淹水胁迫时间延长,5种砧穗组合的甜樱桃幼苗光合速率、气孔导度、蒸腾速率、Fv/Fm逐渐下降,而胞间CO2浓度、初始荧光参数、H2O2、O2-和脯氨酸含量呈上升趋势。将13个指标经隶属函数分析发现5种甜樱桃砧木嫁接苗的抗涝性为考特>本溪山樱>大青叶>尖嘴红樱>莱阳矮樱。[结论]以考特为砧木的甜樱桃抗涝能力最强。

青海湖裸鲤HIF-2α基因的克隆及其ODD功能域羟化分析

目的:克隆青海湖裸鲤低氧诱导因子-2α(HIF-2α)完整编码区,并分析HIF-2αODD域与脯氨酸羟化酶3(PHD3)的相互作用。方法:通过RT-PCR与RACE克隆青海湖裸鲤HIF-2α基因序列,GST pull-down法分析HIF-2αODD域能否与PHD3相互结合。结果:获得的青海湖裸鲤HIF-2αcDNA序列长为3 013 bp,其中开放阅读框(ORF)为2 502 bp。GST pull-down分析表明,HIF-2αODD域羟化后能与PHD3形成酶/底物聚合物。结论:青海湖裸鲤HIF-2αODD域没有发生类似HIF-1α的羟化位点变异,能够被PHD3正常识别并结合。

鲤科鱼类HIF-1的研究进展

低氧诱导因子1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是动物低氧应答的关键转录因子。与哺乳动物相比,硬骨鱼类所处水环境的氧浓度波动范围更大。在鲤科鱼类中,热带鱼类斑马鱼是一种常见的模式动物,而鲫鱼是低氧耐受能力最强的淡水鱼类之一。介绍了HIF-1的结构以及氧依赖的降解途径,分析了低氧、温度和重金属对鲤科鱼类HIF-1及其靶基因表达水平的影响。

高原鼢鼠HIF-2α的定点突变与真核表达

高原鼢鼠(Myospalax baileyi)是一种世居青藏高原东部的地下小型穴居啮齿类动物,其生活环境最大的特点是低氧和高二氧化碳。低氧诱导因子-2α(Hypoxia Induced Factor,HIF-2α)是调节动物低氧适应的主要转录因子之一。在高原鼢鼠的HIF-2α氨基酸序列中,其他脊椎动物保守的第480位苏氨酸变异为丝氨酸。通过真核表达载体构建、定点突变和瞬时转染,真核表达获得GFP融合蛋白,为进一步研究该物种中特有的480位丝氨酸变异对HIF-2α磷酸化修饰和转录活性的影响奠定基础。

鱼类瘦素受体研究进展

瘦素受体是一种跨膜受体,属于I类细胞因子受体家族成员,广泛分布于动物机体的中枢及外周组织,在瘦素发挥生理调节功能的过程中起决定性作用。文章对鱼类瘦素受体的亚型分类、结构特点、信号通路、组织表达分布及其表达影响因素等研究现状进行综述,发现有关水温、p H和盐度等水体环境因子对鱼类瘦素受体表达水平影响的系统研究相对缺乏,因此今后应重点对比研究鱼类与哺乳动物间的瘦素受体生理学,揭示二者在结构特点和生理功能等方面的差异,并从进化角度探讨瘦素受体及其配体在演化过程中所扮演的角色;分析不同水体环境及鱼类各生长发育阶段中瘦素受体的基因表达调控模式,为水产养殖条件优化与品种选育等提供理论依据。

金鱼HSC70和HSP40基因克隆及其原核表达

【目的】克隆金鱼热激同源蛋白70(HSC70)和热休克蛋白(HSP40)基因,构建原核表达载体并通过IPTG诱导表达获得目的蛋白,明确HSC70和HSP40蛋白的生物学功能,为揭示金鱼的高温应答机制打下基础。【方法】提取金鱼鳃组织总RNA,利用RT-PCR扩增金鱼HSC70和HSP40基因,将目的基因片段克隆至线性空表达载体p ET-32a上构建原核表达载体p ET-32a-HSC70和p ET-32a-HSP40,转化大肠杆菌Rosetta表达菌株后用IPTG进行诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blotting检测分析表达获得的融合蛋白。【结果】金鱼HSC70基因CDS序列全长1950 bp,编码650个氨基酸;金鱼HSP40基因CDS序列全长996 bp,编码332个氨基酸。金鱼HSC70氨基酸序列与斑马鱼、人类、家鼠、金线鲃和草鱼的相似度分别为96.28%、95.50%、95.35%、98.15%和98.61%;HSP40氨基酸序列与斑马鱼的完全一致(相似度100.00%),与普通鲤鱼、金线鲃、人类和家鼠的相似度均为94.12%。原核诱导表达获得的融合蛋白TrxHSC70和Trx-HSP40为可溶性表达,其大小约91.5和55.0 k D,均能与Anti-Trx抗体发生特异性反应。【结论】HSC70和HSP40蛋白在鱼类及哺乳动物中高度保守,经原核诱导表达获得的金鱼融合蛋白Trx-HSC70和Trx-HSP40为可溶性表达,且携带有Trx标签,能与Anti-Trx抗体发生特异性反应,可作为互作蛋白用于RNA pull down试验。

低氧与HIF-1对谷氨酰胺代谢的影响

在氧气充足的情况下,葡萄糖可以通过糖酵解和线粒体柠檬酸(TCA)循环为细胞提供能源和碳源。低氧会使TCA循环和电子传递链(ECT)受到抑制,葡萄糖无法被完全氧化,细胞缺乏能源和碳源。为了补充碳源和能源,低氧细胞促进谷氨酰胺代谢途径合成的柠檬酸参与TCA循环,为细胞提供必要的能源和碳源,低氧诱导因子(HIF-1)参与了这一调控。本文主要介绍了低氧环境下的谷氨酰胺代谢,分析了HIF-1与谷氨酰胺代谢之间的相互作用,为低氧糖代谢的调控机制提供理论依据。

HIF-1反义核酸对金鱼HIF-1α及其靶基因VEGF表达水平的影响

金鱼是低氧耐受能力最强的淡水鱼类之一,低氧诱导因子-1(hypoxia induced factor,HIF-1)在动物低氧应答调节中发挥关键作用,目前尚没有关于鱼类HIF-1抑制剂的研究报道。试验分析了HIF-1反义寡聚核苷酸对金鱼肝脏组织HIF-1及其靶基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的基因表达差异。荧光定量PCR结果显示,低氧状态下,30,60 mg/kg剂量的反义核酸能有效抑制VEGF基因的表达,但对HIF-1αm RNA水平没有影响。制备金鱼HIF-1兔源多克隆抗体并进行Western Blot分析,结果显示,60 mg/kg剂量的反义核酸抑制低氧所诱导的HIF-1蛋白水平的上升,表明合成的反义核酸能够特异性地抑制金鱼HIF-1 m RNA的翻译。金鱼HIF-1抗体的合成及反义寡聚核苷酸的制备,可为进一步探索金鱼独特的低氧应答机制提供有效研究手段。

低氧对金鱼鳃形态重塑过程中EMT途径的影响

为探究金鱼鳃形态重塑过程中低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)对细胞黏附的影响,以金鱼鳃组织为材料,通过克隆金鱼E-钙黏蛋白(E-cadherin)基因约2000 bp的启动子区域,对启动子转录位点进行了生物信息学分析,并通过荧光定量PCR检测了相关基因的表达水平,利用免疫组化对金鱼鳃组织中的E-cadherin蛋白进行了定位.结果表明:金鱼E-cadherin启动子区序列可能存在Twist,GCM-1和HOXB9等多个转录结合位点;低氧促进金鱼鳃组织上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)途径关键转录因子Snail的表达,但对另一个关键转录因子Twist无明显作用;低氧处理促进金鱼鳃组织E-cadherin蛋白的表达,这一过程可以被蛋白酶体抑制剂Botezomib和HIF-1α反义核酸处理抑制.研究结果显示,低氧对金鱼鳃组织EMT相关基因的调控模式与人类、小鼠等哺乳动物存在一定区别,可为后续金鱼鳃形态重塑机制的研究提供参考.

E-Cadherin的表达调控及对细胞增殖的影响

E-钙粘蛋白(E-cadherin)主要在上皮细胞膜上表达,发挥细胞间粘附作用并抑制入侵,其在细胞增殖的过程中也扮演着重要角色,主要通过Wnt,Hippo信号通路及Rho家族的小GTPases影响上皮细胞的增殖。E-cadherin在细胞膜上的稳定性和准确的功能通过与连环蛋白(catenin, CAT)形成稳定的复合物来实现。E-cadherin功能缺失在癌症细胞中被发现,其表达失调主要发生在表观遗传学水平。E-cadherin表达水平下降与肿瘤的出现、分化、侵入和运动转移等密切相关。本文主要介绍了E-cadherin对细胞增殖的影响,分析了其在肿瘤发生和发展过程中调节细胞增殖、侵袭和细胞内信号传导的一些分子机制。

低温胁迫下佛手和枳乙烯应答因子6(ERF6)表达变化的比较分析

以柑橘属寒敏感植物佛手‘青皮’品种叶片cDNA为模板,通过RT-PCR与RACE扩增,获得一个1160bp的乙烯应答因子(ethylene response factor,ERF)基因的cDNA序列,其基因编码区共999bp,含有一个保守的AP2/EREBP结构域,与拟南芥AtERF6为同源基因,命名为CmsERF6(GenBank登录号为HQ698835)。4℃低温处理佛手和枳(柑橘属近缘种耐寒植物)植株,测定其寒胁迫生理指标(电解质渗出率、丙二醛含量)。使用实时荧光定量PCR,对佛手和枳叶中的ERF6表达含量进行测定分析,结果表明:低温对佛手与枳的ERF6表达均具有诱导作用,且表达量的变化趋势存在明显的差异。尤其在枳中,ERF6的表达较对照组上升约4000倍,且电解质外渗率的变化与ERF6基因表达量变化具有一致性,说明ERF6基因参与低温胁迫应答。

基于核酶技术的人线粒体色氨酸tRNA的高效转录及其活性鉴定

利用T7RNA聚合酶(T7 RNA polymerase,T7 RNAP)的体外转录方法因其简便、高效而在RNA制备中得到广泛应用,但该法由于T7RNAP的启动子跨越转录起始位点而会导致转录产物多出附加序列;如果去掉T7启动子的转录起始位点,则会严重降低T7RNAP的转录活性。本实验很好地消除了以上弊端,将T7RNAP的高效转录系统与核酶高度专一的自剪切技术相结合,成功构建了一种不影响转录效率的体外转录方法,而且转录后核酶能够在设计的特定位点进行自剪切并释放出目的RNA,得到了活性达113.6pmol/μg的人线粒体色氨酸tRNA(HmtRNATrp(UCA))。该方法转录效率高、重复性好,适合RNA的大量精确制备。