人红细胞生成素cDNA在COS7细胞中高效表达

利用基因重组、PCR扩增、定点突变及转译优化等程序,构建了人红细胞生成素重组表达载体pCSV-EPO,并利用DEAE-dextran法转染猴细胞系COS7获得了EPO的暂时性高表达,EPO-ELISA定量测定表达水平:转染后48h收集的上清EPO量为25ng/ml,72h为17ng/ml。

伤寒菌苗的研究概况

伤寒仍然是发展中国家的多发传染病,伤寒杆菌抗药性的产生给治疗带来了较大的困难。用菌苗免疫易感人群不失为控制伤寒流行的重要手段。目前普遍使用的灭活菌苗效果较差,且有副反应,不易被接受。国外研究V_1多糖菌苗经人群试验后有较好的免疫效果,且不产生副反应,有推广价值。伤寒减毒口服活菌苗Ty21a已有商品供应,人群试验表明有一定保护效果,但仍有许多不足之处。由于遗传工程技术的发展,已在鼠伤寒杆菌进行减毒机理及免疫应答研究,从而将构建出安全有效的无副反应的伤寒口服活菌苗株。

萤火虫荧光素酶基因cDNA真核表达载体在细菌中的高效表达

将萤火虫荧光素酶基因cDNA真核表达载体pGL2 导入大肠杆菌HB1 0 1、鼠伤寒杆菌LB50 0 0和X4 0 64中 ,它在这些原核细胞中均有较好的表达效果。它在大肠杆菌HB1 0 1的表达量是该基因cDNA原核表达载体 pUHF12 - 1的表达量的 3 0倍。采用计算机PC/GENE程序包分析 ,pGL2 的SV4 0 早期启动子序列中含有SV4 0 基因组HindⅢB片断中一段长为 4 9bp的DNA序列 ,这一序列可能就是SV4 0 基因组HindⅢB片断的原核增强子功能的决定序列 ,正是该序列使pGL2 在细菌中获得了高效表达。

重组人促红细胞生成素cDNA在CHO-dhfr^-细胞中的高效表达

目的：使重组人促红细胞生成素（ｒｈＥＰＯ）在ＣＨＯ细胞中获得高效表达。方法：利用基因重组构建了两个人促红细胞生成素ｃＤＮＡ重组表达质粒ｐＥＤ－ＥＰＯ和ｐＥＦ－ＥＰＯ，分别用ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，作瞬时高表达，选ｐＥＦ－ＥＰＯ用磷酸钙共沉淀法转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，加入氨甲喋呤（ＭＴＸ）扩增、选择，作稳定性高表达。结果：ｐＥＤ－ＥＰＯ和ｐＥＦ－ＥＰＯ转染ＣＯＳ７细胞后７２ｈ表达量分别为１７．８和２１．０ｎｇ／ｍｌ，ｐＥＦ－ＥＰＯ转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，随着ＭＴＸ浓度的增加，ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＋的克隆数减少，而混合克隆的ＥＰＯ表达量逐渐升高。筛选了一株稳定性高表达ｒｈＥＰＯ的细胞株，其３ｄ表达量为１６μｇ／ｍｌ。

重组人粒细胞集落刺激因子cDNA在哺乳动物细胞中高效表达的研究

利用ＰＣＲ反应、ＤＮＡ测序、基因重组等技术，构建了两个表达人粒细胞集落刺激因子ｃＤＮＡ的重组质粒ｐＥＤ－ＧＣＳＦ和ｐＥＦ－ＧＣＳＦ，两质粒分别转染ＣＯＳ７细胞作瞬时表达，转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞作稳定表达。结果两质粒在ＣＯＳ７细胞和ＣＨＯ细胞均获得了表达，ｐＥＤ－ＧＣＳＦ转染ＣＯＳ７细胞４８ｈ、７２ｈ的表达量分别为５２×１０４ｐｇ／ｍｌ和２３×１０５ｐｇ／ｍｌ，ｐＥＦ－ＧＣＳＦ转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ、７２ｈ的表达量分别为２８×１０５ｐｇ／ｍｌ和１４×１０５ｐｇ／ｍｌ。转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，随着加入的氨甲喋呤（ＭＴＸ）浓度升高，ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＋克隆数减少，但平均每个克隆的ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量升高，在０５μｍｏｌ／ＬＭＴＸ下最高表达ｒｈＧ－ＣＳＦ细胞株的量是４４６μｇ／ｍｌ／３ｄ。且表达的ｒｈＧ－ＣＳＦ注射小鼠腹腔可提高小鼠外周血白细胞的数量。

rhG-CSF cDNA高表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５＇ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组入表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ｐＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５２ｎｇ／ｍｌ，７２ｈ为２３０ｎｇ／ｍｌ，显示ｒｈＧ－ＣＳＦ获得了暂时性高表达。结论：ｐＥＤ－ＧＣＳＦ是一个能在哺乳动物细胞中高效表达ｒｈＧ－ＣＳＦ的真核表达质粒。

SV40早期启动子中原核增强子样序列的初步研究

萤火虫荧光素酶基因 c DNA真核表达载体 p GL2 可在原核细胞中高效表达 .该载体中含有 SV4 0早期启动子及荧光素酶基因 c DNA 5’端总长共 75 8bp的 DNA碱基序列 ,经计算机分析发现 ,在 SV4 0早期启动子中含有 SV4 0基因组 Hind B片断中一段长为 4 9bp的 DNA序列 ,且荧光素酶基因 c DNA编码区的 5’端含有一个原核细胞基因表达调控区相似序列 .将 p GL2 中的荧光素酶基因 c DNA(L uc)克隆入真核表达载体 p ED中 ,构建成 p ED- Luc.该载体经表达测定后 ,只在真核细胞中表达 ,在原核细胞中不表达 .这说明荧光素酶基因 c DNA编码区的 5’端的原核细胞基因表达调控区相似序列不具表达有活性的荧光素酶的功能 .经 DNA序列对比研究 ,认为 p GL2 含有的 SV4 0基因组 Hind B片段 5 12 3bp～ 5 171bp长 4 9bp的 DNA序列可能就是 Hind B片段的原核增强子功能的决定序列 .

丁酸钠对CHO-EPO工程细胞株rhEPO表达量的影响

以稳定整合有ｐＥＤＥＰＯ的ＣＨＯＥＰＯ工程细胞株为研究对象，在无血清条件下，系统观察了０５、１０、２５和５０ｍｍｏｌ／Ｌ４个浓度的丁酸钠作用于该细胞株的情况，结果表明：丁酸钠对ＣＨＯＥＰＯ工程细胞的生长有明显的抑制作用；影响ＣＨＯＥＰＯ工程细胞ＥＰＯ表达，浓度１０ｍｍｏｌ／Ｌ可提高ＥＰＯ表达量２５倍左右，并可持续较长的一段时间；延缓ＣＨＯＥＰＯ工程细胞在无血清培养时的细胞脱落；

伤寒-鼠伤寒基因重组菌株Vi4072与伤寒Ty2株和枸橼酸杆菌的Vi抗原比较

将来源于枸橼酸杆菌编码产生Vi抗原的ViaB基因片段,通过基因重组技术引入减毒的鼠伤寒杆菌而组建的Vi4072重组株与伤寒沙门氏菌Ty2株和枸橼酸杆菌的Vi抗原,通过琼脂双向扩散试验、被动血凝试验、对BALB/c小鼠的免疫力试验以及对Vi抗原分子的化学元素含量、红外光谱、超导核磁C谱、H谱分析测试。结果表明上述三种菌株产生的Vi抗原其血清学特性、免疫保护作用及化学分子结构等基本相同。且Vi4072重组株表达Vi抗原量高于伤寒Ty2株。

伤寒─鼠伤寒重组株Vi4072在小鼠中定居及血清学效果观察试验

以伤寒─鼠伤寒双价重组株Ｖｉ４０７２的３×１０８ＣＦＵ一次口服感染ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，４天后即可从小鼠的集合淋巴结、肝、脾中分离到该菌，４９天后该菌始被小鼠机体彻底清除。血清和小肠匀浆液中Ｖｉ抗体检测结果证明Ｖｉ４０７２菌株有刺激特异性免疫应答的功能。血清、小肠匀浆液中Ｖｉ抗体明显升高。

伤寒─鼠伤寒重组株Vi4072的效力试验研究

伤寒─鼠伤寒重组株Ｖｉ４０７２所产生Ｖｉ抗原以伤寒Ｔｙ２株所产Ｖｉ抗原作对照，通过ＥＤ５０测定和小白鼠被动保护试验作了比较，结果表明Ｖｉ４０７２株Ｖｉ抗原的半数有效剂量为０．０１３６μｇ，Ｔｙ２株的半数有效剂量为０．０１８３μｇ，说明Ｖｉ４０７２─Ｖｉ对小白鼠的保护作用不低于Ｔｙ２─Ｖｉ。被动保护试验证明，在同等条件下，两种Ｖｉ抗原的免疫血清对小白鼠提供的保护作用相同。

转译优化对EPO基因在COS7细胞中表达的影响

利用COS7细胞暂时表达系统,研究转译起始序列对EPO-cDNA表达的影响。通过DNA重组技术,构建了原EPO-cDNA表达载体pCSV-EPO(1),其转译起始序列为5＇AATTCATGG3＇。同时通过定点突变技术,将起始序列改变成5＇CCACCATGG3＇,而构建了另一表达载体pCSV-EPO(2)。后者经序列分析证明无误后和前者均通过DEAE-dextran法转染COS7细胞,用ELISA法定量测量EPO表达水平,转染后48小时及72小时收集含pCSV-EPO(1)的COS7细胞上清,测定结果为1580pg/ml及954pg/ml,而含pCSV-EPO(2)的上清则为25300pg/ml和17450pg/ml。这表明经优化起始序列的基因表达远高于未经优化的。

重组细胞株CHO-105C3无血清培养及人促红细胞生成素的表达

促红细胞生成素(EPO)是人体红系造血的特异性调节因子,它具有促进红系祖细胞生长、分化发育的功能。许多资料表明,肾脏是EPO的主要来源,严重肾功能紊乱患者。

伤寒-鼠伤寒重组株Vi4072在小鼠中定居及血清学效果观察试验

将编码Vi抗原的基因克隆到减毒的鼠伤寒沙门氏菌中组建的基因重组株Vi4072,以3×10~8CFU一次口服感染Balb/C小鼠,4天后按7,14,21,28,35,42,49,56,63,70天的间隔收集分离小鼠的集合淋巴结,肝,脾.鉴别是否有本菌出现,并检测血清和小肠匀浆液中的vi抗体.结果表明,感染后49天仍可从脾中分离到该菌;70天仍可从血清和小肠匀浆液中测出vi抗体。

两个不同启动子在COS7细胞中转录效率的比较

两个不同启动子在ＣＯＳ７细胞中转录效率的比较陈坚刘小萍曹韫旭陆德如（第二军医大学医学生物技术和分子遗传研究所，上海２００４３３）ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌＥｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＴｗｏＤｉｆｆｅｒｅｎｔＰｒｏｍｏｔｅｒ...

肝细胞癌组织Ⅲ型胶原的来源

目的:研究肝细胞癌组织中Ⅲ胶原的细胞来源及其基因表达。方法:6例正常肝组织及23例肝细胞癌组织Ⅲ型胶原免疫组化染色采用卵白素—生物素—过氧化物酶法,2例正常肝及9例肝细胞癌组织胶原是因表达检测采用原位核酸杂交技术。结果:正常肝组织及癌旁肝组织非活动性肝病的胶原合成处于静止状态,癌旁活动性肝病时可见间质细胞胶原蛋白及基因表达。癌组织中胶原表达明显增强,癌细胞胶原合成强于间质细胞。结论:①癌旁肝组织合成胶原可能是肝病活动的结果,肝细胞不参与胶原合成;②癌组织中胶原主要来源于癌细胞。