低温胁迫期间水稻光合膜色素与蛋白水平的变化

对４℃和１１℃两种低温胁迫过程中水稻类囊体膜色素与蛋白组成的变化进行了比较研究。结果表明：４℃低温不仅使类囊体膜中的光合色素（叶绿素、类胡萝卜素）含量降低，而且还引起膜蛋白组成的深刻变化，表现在大部分原有膜蛋白组分的含量在低温下明显降低，同时在低温处理的第３ 天诱导出一条３２．５ ｋＤ 的新蛋白带。与４℃处理相比，１１℃低温处理只引起了光合色素含量的降低，而对类囊体膜蛋白组成的影响不大。另外发现，两种低温处理在引起光合色素含量降低的同时，还引起ｃｈｌａ／ｂ 比值的明显变化。在低温处理的初期（４℃，１ ｄ和１１℃，２ ｄ），ｃｈｌａ／ｂ 比值有一明显下降，而此后又逐渐升高。这一结果暗示，植物光合器的反应中心可能比其天线组分对低温胁迫更敏感。

嗜酸乳杆菌ATCC4356 S-层蛋白的克隆、表达和纯化

目的克隆嗜酸乳杆菌S层蛋白的编码基因,使其原核表达并纯化表达产物。方法对嗜酸乳杆菌S层蛋白(S-layer protein)基因进行提取和扩增,连接pET-SUMO3表达载体并转入大肠杆菌内使其表达;采用镍柱亲和层析技术对S层蛋白进行提取及纯化,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting验证表达产物。结果嗜酸乳杆菌ATCC4356的S层蛋白编码基因(1 263 bp)被克隆,且与相关基因有98%同源性。SDS-PAGE及Western blotting证明,重组融合蛋白在细菌中能够高效表达且部分融合蛋白可经亲和层析及酶切去除融合标签获得重组S-层蛋白(43 0000 Da)。结论通过获得嗜酸乳杆菌S-层蛋白编码基因的方法可实现其原核表达,并得到纯度较高的S层蛋白,为后续的生物学功能研究奠定了基础。

对乳头状甲状腺癌临床分子靶标的筛选

目的:通过对比分析乳头状甲状腺癌(papillary thyroid cancer,PTC)和癌旁组织中NF-κB信号通路相关基因的差异表达,以及52个实体瘤相关基因的突变情况,鉴定与PTC临床诊断治疗相关的肿瘤特异性分子靶点。方法:分别提取20例PTC石蜡样本的癌与癌旁组织的RNA及DNA,运用定量反转录聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)分析NF-κB信号通路目的基因CD44、BCL2、CCND2、c-FLIP、IκBα、A20及ABINs的RNA水平表达,并用免疫组化方法进行蛋白水平表达验证。同时利用靶向二代测序(next generation sequencing,NGS)对其中5例随访复发病例的肿瘤相关基因的突变情况进行全面分析筛选。结果:PTC癌组织中CD44和CCND2基因在RNA和蛋白水平的表达均显著高于癌旁组织。在有淋巴结转移和无淋巴结转移的PTC间,各NF-κB目的基因的表达量差异均无统计学意义。在基因水平,ALK、BRAF、FGFR3/4、KIT、MYC及MAPK信号通路的HRAS、KRAS、NRAS及RET是PTC中的高频突变基因。有2例病例分别含35个和40个突变基因,存在很大肿瘤负荷,结合临床数据发现均为术后复发患者。常见的BRAF V600E突变并非都是体细胞突变(64%),也可为胚系突变(29%);用NGS和qPCR同时检测验证V600E时,2种方法检出结果的相符率达80%。结论:CD44和CCND2基因在乳头状甲状腺癌癌组织中高表达,BRAF、RAS、FGFRs、KIT和MYC等基因的肿瘤特异性突变可能作为临床上对PTC患者实施个体化治疗所需的分子靶点。NGS和qPCR技术对BRAF V600E检测具有很高平行性,联合应用可提高检出率。

儿童伯基特淋巴瘤中差异表达基因的鉴定及临床应用

目的:分析儿童伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma,BL)组织与正常淋巴结组织中磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositide3-kinase,PI3K)信号通路、核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路及RAS/RAF信号通路等相关基因在mRNA及蛋白水平上的表达差异,探讨这些基因及相关信号通路与BL发生、发展间的关系,鉴定可用于BL临床诊断、治疗的特异性分子靶标。方法:收集18例儿童BL的组织切片和20例无癌变儿童淋巴结组织(对照)切片,用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)分析上述信号通路相关基因mRNA水平的表达情况,并用免疫组组化学技术进行蛋白水平表达的分析验证。结果:与对照相比,MYC、TCF3、ID3、CCDN3、CDK6、CDK4、NRAS、RAF1等基因及相应的蛋白在肿瘤组织中高表达,而一些NF-κB信号转导通路目的基因(如BCL2、CD44、CCND2、C-FLIP、A20)表达则受到抑制(P<0.05)。c-MYC基因易位伴BCL2表达(BCL2+)的儿童BL患者其血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平升高(P<0.05)。结论:MYC、TCF3、CCND3、CDK6、NRAS和RAF1等基因在儿童BL中高表达,可作为临床BL诊断和治疗监控的分子靶点;c-MYC基因易位伴BCL2+在儿童BL中与高LDH水平相关,其提示患儿具有较晚的肿瘤分期、较大的肿瘤负荷及不良的预后,可作为临床辅助诊断BL的重要分子指标。

液体活检在结直肠癌中的应用进展

近年来二代测序发展迅速。目前,市场上已有多套临床自动化测序系统,突破了循环肿瘤DNA(ct DNA)在检测技术上的限制。ct DNA和循环肿瘤细胞(CTC)检测对优化结直肠癌临床治疗有重要意义。尤其是在术后复发监测及靶向药物用药后的耐药分析方面,ct DNA与CTC的应用已十分接近临床且被证明效果优于现有检验手段。此外,在结直肠癌的早期筛查领域,ct DNA也表现出巨大的应用潜力,已有实验策略可准确识别肿瘤原发灶。未来,在标准化实验流程并完善大样本临床对照研究后,液体活检将成为结直肠癌的主要检测方法。