水曲柳FmCCoAOMT基因在木质素合成及非生物胁迫中的功能分析

为了明确FmCCoAOMT基因的功能,以水曲柳(Fraxinus mandshurica)为材料,利用qRT-PCR方法分析FmCCoAOMT基因的表达模式,结果显示FmCCoAOMT基因具有组织特异性。在雌株和雄株多年生木质部的表达量最高,其中在雄株中是新生枝皮表达量的9.4倍,在雌株中是叶片表达量的13.1倍。采用叶盘法获取转基因烟草(Nicotiana tabacum)植株,过表达FmCCoAOMT的烟草与野生型相比,木质素含量升高41%,纤维素和半纤维素含量分别降低32%和52%。非生物胁迫处理后过表达FmCCoAOMT烟草相比于野生型,POD和SOD活性增加,MDA含量下降,且活性氧含量减少,其中NaCl处理后,POD活性比对照组升高83%;NaCl、ABA和甘露醇处理后,SOD活性比对照组分别升高56.6%、44.2%和19.0%,MDA含量比对照组分别降低了77.2%、11.7%和47.6%。结果表明FmCCoAOMT基因通过参与木质素合成,促进非生物胁迫适应能力。

转基因白桦中GUS基因表达的定量分析

以转基因白桦(Betula platy phylla)为材料,采用单酶切结合Southern杂交的方法揭示不同转基因植株中GUS基因的整合拷贝数为1-4个。采用组织化学染色法定性分析不同整合方式转基因白桦植株中GUS基因的表达。结果表明,11个转基因植株中有2株出现了GUS基因沉默,其余植株均有不同水平的GUS表达。在此基础上应用分光光度法定量分析不同拷贝数的GUS转基因白桦中β-葡萄糖醛酸酶活性。结果表明,在11个转基因无性系中除2个株系的GUS基因沉默外,其它9个转基因植株中GUS酶活力差异明显,但这种差异与GUS基因的拷贝数没有必然联系。

富含多糖和次生代谢产物的白桦成熟叶中总RNA的提取

分别采用CTAB法、SDS法、异硫氰酸胍法和缓冲液冰浴-CTAB法从转基因白桦成熟叶中提取总RNA,并对琼脂糖凝胶电泳和紫外光谱分析进行比较。结果表明,缓冲液冰浴-CTAB法提取的总RNA纯度高、完整性好且得率高.应用此法提取的总RNA能够满足RT-PCR和Northern杂交分析要求。

转基因白桦的花粉活力及外源基因的遗传表达分析

采用荧光素二乙酸酯(FDA)染色比较分析转基因白桦花粉的活力的结果表明,转基因白桦的花粉活力均低于非转基因白桦。应用多重PCR和Northern杂交技术分析表明,转基因白桦花粉中有外源基因整合和转录表达。检测转基因白桦花粉中gus报告基因的活性,显示gus报告基因在花粉表达。

转基因植物中外源基因的整合特性及其研究策略

综述了外源基因在宿主中的整合特性及结构变化的多样性。将外源基因在宿主中的整合方式分为3种:单拷贝单位点整合、串联多联体单位点整合及单拷贝或多拷贝在多位点整合。分析了不同整合方式对表达的影响。详细讨论了植物转基因的整合机制,阐述了以基因组的双链断裂修复为基础的整合模型。最后介绍了国内外的研究者对不同的整合方式所采取的研究策略。

水曲柳结构域重新甲基化酶DRM基因片段的克隆及同源性分析

[目的]克隆并分析水曲柳结构域重新甲基化酶(DRM)基因片段。[方法]根据GenBank上已发表的DRM氨基酸序列,采取CODEHOP方法设计合成1对简并引物,采用RT-PCR技术对水曲柳DRM基因进行扩增,将PCR产物与pMD 18-T连接后转化至E.coli JM109感受态细胞,检测阳性克隆,测序并进行序列分析。[结果]克隆得到的DRM基因cDNA序列长802 bp,由267个氨基酸残基组成,命名为FmadrmA。序列比对表明FmadrmA与参考的12个物种的DRM在氨基酸水平上表现出较高的同源性,其与山葡萄、番茄、黄瓜、野草莓、大豆、苜蓿、玉米、烟草、拟南芥、毛果杨、水稻和乌拉尔图小麦的DRM同源性分别为61%、54%、51%、50%、60%、48%、43%、44%、37%、42%、42%和39%。系统进化树分析表明同源的DRM蛋白可大致聚为3类,而水曲柳与其他植物的亲缘关系较远。[结论]该试验成功获得了水曲柳FmadrmA基因片段,并对其进行了同源性分析,为进一步研究结构域重新甲基化酶基因及分析其表达特性奠定了基础。

抗体夹心BGT-ELISA方法的建立及在转基因白桦中的应用

以蜘蛛杀虫肽与Bt-toxinC肽融合蛋白基因(bgt基因)的表达产物的定量分析为研究目标,采用原核表达及纯化出融合蛋白His-BGT作为抗原进行兔免疫,得到相应的抗血清,采用ELISA法检测效价在1:10000以上,并对抗血清进行了免疫亲和层析,获得了高纯度的IgG,Westernblot检测具有较好的特异性。采用过碘酸钠法将抗体标记辣根过氧化物酶(HRP),得到第二抗体即酶标抗体,标记率在85%以上。建立起检测BGT杀虫蛋白的快速、灵敏的方法。应用该检测方法,分析了不同转基因白桦(BetulaplatyphyllaSuk.)株系中BGT蛋白含量占叶片可溶性总蛋白含量的0.05%～0.3%,并利用Westernblot验证了此方法是可靠的。说明抗体夹心BGT-ELISA方法能够定量分析转基因植株中BGT蛋白的含量,为转bgt基因植物的检测和应用奠定了基础。

农杆菌介导外源基因转化及整合机制的教学探讨

从学生的实际情况出发,针对"农杆菌介导外源基因转化及整合机制"这部分教学内容抽象、枯燥、难于理解的特点,从结合最新研究进展、整合模型讲授、实施研究性教学、开展综合性实验几方面探讨了教学改革,以促进学生的学习积极性,提高教学效果。

水曲柳生长性状种源与地点互作及优良种源选择

【目的】选育适生于帽儿山、带岭、露水河试验地及毗邻地区的生产力高、稳定性好的水曲柳种源。【方法】以帽儿山、带岭与露水河等试点的20个水曲柳种源为材料,对其14年生树高、胸径和材积进行调查并进行单点、多点方差分析与多重比较,然后用Eberhart&Russell联合回归分析法的回归系数bi对20个水曲柳种源进行稳定性分析,最后用趋势面对水曲柳的地理变异进行分析。【结果】1)水曲柳树高、胸径和材积在种源间、地点间、种源和地点交互作用间差异均极显著;其中露水河试点树高较大的种源依次为海林(7.55 m)、带岭(7.34 m)、露水河(7.05 m),胸径较大的种源依次为海林(6.13 cm)、露水河(5.47 cm),材积最大的种源为海林(14 909 cm3);帽儿山试点树高最大的种源为五常(7.62 m),胸径最大的种源为五常(6.79 cm),材积最大的种源为五常(16 747 cm3);带岭试点树高较大的种源依次为兴隆(5.67 m)、临江(5.65 m)、东方红(5.61 m),胸径最大的种源为临江(5.07 cm),材积最大的种源为临江(7 984 cm3)。3个试点树高表现优良的种源为五常(6.35 m);胸径最大的种源为临江(5.35 cm);材积最大的种源为海林(10 546 cm3)、材积排名第二的种源为五常(9 857 cm3)、材积排名第三的种源为临江(9 818 cm3)。2)稳定性分析结果表明友好、临江、西丰、带岭、汪清、汤旺河6个种源具有平均稳定性,兴隆、露水河、恒仁、海林、弯甸子、绥棱、三岔子7个种源具有高稳定性,辉南、帽儿山、方正、东方红、沾河、桦南、五常7个种源稳定性较差,在有利的环境条件下才具有很大的丰产潜力。3)地理变异分析表明纬度对水曲柳生长具有较大的影响,在西北—东南这一条直线附近的种源材积较高,随着与西北—东南一线距离的增大而降低。【结论】通过比较2年、6年与14年林龄的种源选择结果,发现相对于2年林龄,6年林龄的选择结果与14年林龄的选择结果更为接近,表明种源选择时期不宜过早。本研究的结果可为我国水曲柳的种质资源管理与持续改良提供积极参考。

水曲柳优树子代测定与家系选育技术

综合生长性状和生物量性状,对黑龙江省伊春市带岭区试验点的53个家系9年生水曲柳表型优树进行子代变异分析,深入探讨了水曲柳家系选育技术。结果表明:水曲柳家系间的树高、胸径、地径和材积的差异均极显著;家系间的树高、胸径、地径和材积的变异幅度均比较大;材积的家系遗传力、遗传变异系数和遗传增益均高于其他生长性状,材积的家系遗传力为69.24%,遗传变异系数为38.98%,遗传增益为23.45%。从54个家系(包括当地对照种源)中按生长量高中低选取10个家系30个单株(包括当地水曲柳对照株)用于生物量分析和建立生物量与生长量的回归方程,进而得到其他参试家系的生物量;方差分析结果表明,参试家系间生物量差异极显著;生物量性状的家系遗传力(71.65%)、遗传变异系数(38.51%)、遗传增益(21.06%)均比较大。以生长量、生物量为指标对参试家系进行选择的结果有较高的一致性。本试验分别选出了10个生长性状优良和10个生物量性状优良的家系,并进一步选出9个生长性状和生物量性状均优的家系,其树高生长量高于对照31.05%～59.82%,其材积生长量高于对照75.22%～246.08%,生物量超过当地对照的17.76%～176.24%。

阿什河源头水源涵养林在水分传输过程中对水质的影响

对阿什河源头地表水来源过程中各环节(包括大气降水、穿透水、树干径流和地表径流)的水化学性质进行分析比较。结果表明:树干径流的酸化最为明显,地表径流对林分水质酸化有很好的缓冲作用;大气降水经过落叶松人工林生态系统后,穿透水和树干径流的电导率、总溶解固体、K和Mg元素含量增加;穿透水7、8、9月Na元素含量都低于大气降水,为负淋溶;对穿透水、树干径流和地表径流而言,Zn元素含量在观测时间内变化趋势相同,都是6—9月逐渐降低;各月树干径流和地表径流的Mn和Fe元素平均含量都高于大气降水和穿透水;地表径流经过林地土壤层的深层交换和净化后汇集成溪水,浊度和总溶解固体含量明显降低;溪水和河水中的Mg和Zn元素含量在观测时间内变化趋势一致,Mg元素含量变化都呈"W"形,Zn元素含量都是6月最高,9、10月份未检出;各月河水中总N、总P、电导率和总溶解固体都高于溪水,且Na、Mg和Ca元素含量也都高于溪水;溪水综合评价结果属于Ⅱ类水体,河水综合评价结果属于Ⅳ类水体。

转基因白桦的遗传变异分析

应用细胞学方法分析了由农杆菌介导法获得的转基因白桦的细胞学变异情况,结果表明转基因白桦的染色体变异频率为78.5％,远远高于非转基因白桦的变异频率(15.3％),且变异以非整倍体占多数。同时用RAPD标记方法研究了转基因白桦在DNA水平的变异情况,结果显示DNA多态性指数为31.67,并与其它转基因植物的变异情况作了比较研究。最后分析、讨论了产生变异的原因:(1)组织培养过程中产生突变;(2)外源基因的整合及重排时宿主基因组的插入位点及相邻基因转录表达的干扰;(3)应用抗生素和除草剂等筛选转基因植株时促进了转基因植株的变异程度。并提出减少转基因植物体细胞克隆变异的建议。

富含多糖的白桦成熟叶片DNA的提取方法

采用常规SDS方法、改良SDS法、常规CTAB法、高盐CTAB法和改良的CTAB法对富含多糖的白桦成熟叶片DNA进行提取,并对得到的DNA进行电泳分析和含量测定,结果表明:改良的CTAB法所提取的DNA纯度高,质量较好,用限制性内切酶酶切后条带均一,证明该方法适于提取白桦成熟叶片的基因组DNA,能满足进一步分析的要求。

小黑杨bHLH转录因子基因和启动子的克隆与分析

为了研究木本植物中同源bHLH(basic helix-loop-helix)转录因子的功能,以小黑杨为研究对象,参照毛果杨序列设计引物进行PCR。获得了2条bHLH转录因子基因以及其上游部分启动子序列,将获得的基因命名为PxbHLH01和PxbHLH02,并对这2个基因进行了详细的生物信息学分析。多序列比对结果表明,与拟南芥编码bHLH转录因子UPBEAT1有较高同源性。系统进化树表明与毛果杨和拟南芥等同源基因亲缘关系较近。启动子顺式调控元件分析结果表明,其启动子区包含有氧应答及其它胁迫相关元件,其功能可能与植物活性氧代谢以及胁迫耐受相关。

植物DNA甲基化及其研究策略

DNA甲基化是表观遗传学研究的热点问题之一, 植物DNA甲基化的研究对植物研究领域的发展有着举足轻重的作用。本文阐述了植物DNA甲基化的相关机制, 其中包括RdDM(RNA-dependent DNA methylation)、DNA 甲基化与组蛋白修饰以及DNA 去甲基化等近几年研究的热点问题; 讨论了DNA甲基化在植物发育中的功能(包括基因组防御和调控基因表达)、 DNA甲基化与转基因沉默的关系以及其在表观遗传学中的地位。最后就目前国内外研究植物DNA甲基化所采取的常用策略, 即高效液相色谱法、亚硫酸盐测序法、甲基化敏感的限制性内切酶结合Southern杂交分析法和MSAP(methylation-sensitive amplified polymorphism)法进行了详尽的介绍和讨论。

黑龙江省东部山地樟子松人工林生态系统水化学特征

对黑龙江省东部山地樟子松人工林(P inus sy lvestr is var.m ongolica)生态系统的大气降水、穿透水、树干径流和枯透水中的pH值、溶解氧、浊度、电导率、氧化还原电位、钾、钠、钙、镁、铜、锌、锰、铁等水质指标进行了观测,结果表明:大气降水经过林冠层后,水化学特征发生了明显变化,pH逐层降低,经过枯枝落叶层后,水质的酸化得到了缓解,说明樟子松人工林的枯枝落叶层对水质酸化有很好的缓冲作用。穿透水、树干径流和枯透水的COND变化趋势相同,且各月树干径流和枯透水的COND平均值均高于穿透水和大气降水。枯透水各月ORP的平均值明显低于大气降水和树干径流,可见樟子松人工林的枯枝落叶层对ORP值的降低有很好的作用。樟子松人工林对于增强水中微量元素F e和M n含量也有很好的作用。

培养基组分、激素及pH值对转基因白桦花粉萌发的影响

采用花粉离体培养法研究了培养基不同组分、激素及pH值对转基因白桦(BetulaplatyphyllaSuk.)花粉萌发的影响。结果表明,培养基组分在一定范围内促进花粉萌发,转基因白桦花粉萌发对硼酸和Ca2+的反应敏感,培养基中缺乏该物质时花粉不萌发。激素类物质低浓度时促进萌发,高浓度时抑制萌发。最适合培养基组分为蔗糖18%,硼酸0.015%,Ca2+0.020%,pH6.0,NAA10mg/ml,6-BA1mg/ml。并对不同保存条件(4℃,-20℃)下转基因白桦花粉的萌发率进行了比较,4℃下干燥保存更有利于保持转基因白桦花粉的活力。

白蜡属种间杂交种F1的种子性状变异分析

对已获得的白蜡属种间杂交种F1代及其亲本的自由授粉子代进行种子性状的调查与分析,比较不同树种、不同父本种源、不同母本基因型、不同父本基因型及花粉是否经过静电场处理对杂交种F1代的种子性状的影响;从杂交种F1代的种子性状方面研究其杂种优势。研究表明:以不同白蜡树种为父本对杂种F1代的种子性状没有显著影响,父本种源不同对杂交种F1代的种子性状没有显著影响,母本基因型不同对杂交种F1代的种子性状影响很大,父本基因型不同对杂交种F1代的种子性状没有显著影响,花粉经适宜高压静电场处理后对杂种F1代的种子性状没有显著影响,白蜡属种间杂交种F1在种子性状方面具有杂种优势。

基因工程开放型实验教学对学生能力的培养

根据基因工程实验具有步骤多、连续性强、需要时间长等特点,利用学院的共享实验平台为基因工程实验设置开放型实验,调动学生学习积极性,激发学生潜能,培养学生严谨的科学态度,促进学生科学思维的形成,从而提高学生的创业意识,拓宽创业方向,以及其他综合素质的提升。这项研究也为今后能更好地开设学生实践活动积累了经验。

白桦BpGT14基因启动子克隆及表达活性分析

本文利用Site Finding-PCR方法克隆了白桦BpGT14基因起始密码子ATG上游2 169 bp序列,并通过PLACE启动子预测工具对其进行元件分析。结果表明,该启动子片段含有启动子核心元件及多种逆境及激素响应元件,同时具有植物苯丙烷及木质素生物合成的MYB类转录因子的重要结合基序。研究选取了其中含有启动子核心元件的1 156 bp片段构建了pBpGT14∷GUS植物表达载体,利用农杆菌侵染的方法将pBpGT14∷GUS报告基因瞬时转化烟草植株,鉴定该启动子在烟草中的表达活性及对非生物胁迫和激素的响应模式。对转基因烟草植株进行GUS染色,结果表明该启动子具有启动活性,且在茎段处活性较高;进一步分析非生物胁迫对烟草中GUS酶活性的影响,表明该启动子对ABA、NaCl、PEG及高温处理均有明显响应,且对于NaCl及PEG处理响应迅速。为了更好的鉴定白桦BpGT14基因启动子在白桦细胞中的启动活性及响应模式,本文构建了pBpGT14∷GFP载体并瞬时转化白桦茎段悬浮细胞,进行研究。GFP转录水平分析结果与GUS酶活性结果基本一致,但其中部分时间点仍存在差异。选取PEG处理3、6、12及24 h的转GFP基因白桦茎段悬浮细胞,在显微镜下观察其绿色荧光蛋白,以此揭示该启动子对干旱的响应模式。结果表明,该启动子在白桦茎段悬浮细胞中启动了GFP的表达,在处理初期(3 h),荧光效果明显;随着处理时间的增加,细胞脱水明显,且在细胞壁表现高亮度荧光。