一种快速简便的缺失突变方法

为了构建能表达稳定的、不易降解的ＴＭ－ＴＮＦ突变体（ＴＭ－ＴＮＦｍ）的基因，本文用改良的Ｓ－ＰＣＲ和ＯＥ－ＰＣＲ两种定位突变技术，成功地构建了缺失３６个碱基的ｐＢＳＫ－ＴＭ－ＴＮＦ突变重组体。与ＯＥ－ＰＣＲ技术（用两对引物进行两次ＰＣＲ反应）相比较，Ｓ－ＰＣＲ技术（用一对引物做一次ＰＣＲ反应）具有快速、经济、简便等优点，但其突变率较ＯＥ－ＰＣＲ低。

跨膜突变型TNF-α的基因构建及体外表达

目的：跨膜型ＴＮＦα（ＴＭＴＮＦα）易在某些蛋白酶的作用下转换为分泌型ＴＮＦα（ＳＴＮＦα）。拟用基因突变技术获得稳定表达的、不能转换成ＳＴＮＦ的ＴＭＴＮＦ突变体（ＴＭＴＮＦｍ）。方法：应用ＲＴＰＣＲ技术，从人外周血单核细胞中扩增出编码ＴＭＴＮＦα的全长ｃＤＮＡ序列并构建ｐＢＳＫＴＮＦα重组体。以此为模板，借助改进的“一次重组ＰＣＲ”定位突变技术，造成ＴＭＴＮＦ转换为ＳＴＮＦ酶切位点的缺失，获得ＴＭＴＮＦ突变重组体（ＴＭＴＮＦｍ）。结果：将ＴＭＴＮＦｍｃＤＮＡ片段克隆至表达载体ｐＧＥＭ３Ｚｆ，利用体外转录翻译系统表达出具有生物学活性的跨膜突变型ＴＮＦα蛋白。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析证实，用胶原酶不能将ＴＭＴＮＦ突变体酶解成为ＳＴＮＦ。结论：提示所构建的ＴＭＴＮＦｍ去除了可转换为ＳＴＮＦ的酶解氨基酸序列，为进一步研究跨膜型ＴＮＦ杀瘤作用奠定了基础。

膜相关型肿瘤坏死因子－α

膜相关型ＴＮＦ－α系一以跨膜方式镶嵌在细胞膜上、分子量为２６ＫＤ的蛋白质。其杀瘤作用机制不同于１７ＫＤ分泌型ＴＮＦ，主要通过效应细胞－靶细胞直接接触发挥局部细胞毒作用，且杀瘤谱广。因此深入、细致研究这类细胞因子的作用特点，探索其分子生物学制备方法，将为肿瘤治疗开辟新的途径。

跨膜型TNF-α生物学活性的膜依赖性

跨膜型TNF-α(TM-TNF-α)是激活的单核/巨噬细胞表达在胞膜上的完整蛋白分子。为了确定TM-TNF与细胞膜的关系,本文借助体外转录翻译系统及微粒体膜结构,建立了表达在微粒体膜上的TM-TNF以及无膜的裸26kD TNF。比较这两种体外表达产物对靶细胞的细胞毒效应,结果表明,只有在微粒体存在时所合成的26kD TNF具有细胞毒活性;而无微粒体存在所合成的裸26kD TNF不显示杀瘤效应。进一步用间接免疫荧光技术观察它们与HL60靶细胞胞膜上TNFR的结合情况,结果显示,结合在微粒体膜上的TM-TNF能与TNFR有效结合,而裸26kD TNF与TNFR则不能有效结合。提示TM-TNF只有“锚定”在细胞膜上,才能利于其空间构型的展示,发挥生物学效应;而一旦与膜分离,则不能与TNFR有效地结合,故丧失了其生物学活性。

增强器官移植耐受性的新策略

当今,器官移植术已如此成熟,仅通过外科手术的改进已难以延长移植物存活时间,而免疫学领域的新进展则可能对改善移植术的疗效起关键作用。受者的免疫系统将移植器官视为“外来异物”,虽然从临床角度看,这种反应对机体不利,但借助同一机制,机体也能显示防御功能,从而有效地清除被病毒感染的细胞等。

TNF-α的合成分泌机制不同于一般的分泌型蛋白

目的拟借助微粒体膜和体外转录翻译系统来研究分泌型ＴＮＦα（Ｓ－ＴＮＦ－α）的产生机制及Ｓ－ＴＮＦ－α和跨膜型ＴＮＦα（ＴＭ－ＴＮＦ－α）的关系。方法首先将分子量为１７×１０３Ｓ－ＴＮＦ（不含编码ＴＮＦ信号肽的基因）、２６×１０３ＴＭ－ＴＮＦ（含信号肽基因）和１７×１０３Ｓ－ＴＮＦ突变体（Ｓ－ＴＮＦｍ，用ＩＬ－２信号肽密码子置换ＴＮＦ信号肽序列）的全长ｃＤＮＡ片段分别亚克隆于含Ｔ７启动子的ｐＧＥＭ－３Ｚｆ载体，然后利用体外转录翻译系统，在微粒体膜存在和不存在的情况下，体外翻译合成Ｓ－ＴＮＦ、ＴＭ－ＴＮＦ及其Ｓ－ＴＮＦｍ。结果经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析结果表明：微粒体的存在并不改变２６×１０３ＴＭ－ＴＮＦ的分子量，但微粒体的存在能将Ｓ－ＴＮＦｍ上的ＩＬ－２信号肽切除，证实ＴＮＦ引导序列与一般分泌性蛋白的“信号肽”不同，在粗面内质网翻译过程中不被切除。进一步酶切分析表明ＴＭ－ＴＮＦ是通过某些金属蛋白酶酶解作用而被转换成Ｓ－ＴＮＦ的。结论实验结果提示１７×１０３Ｓ－ＴＮＦ产生机制可能是：ＴＮＦ产生细胞经ＬＰＳ等激活后，导致ＴＮＦ基因转录翻译增加，首先形成２６×１０３ＴＮＦ，并借助其信号肽疏水氨基酸部分将之“锚定”?

膜结合型淋巴毒素及其LT-β亚基

淋巴毒素(LT)存在分泌型及膜结合型两种表达形式。膜型LT是由分泌型亚单位LT-α通过跨膜亚单位LT-β连接在细胞膜上,构成一个异源三聚体结构。LT-β亚基为TNF配体超家族成员之一,其相应的特异性受体为TNF受体相关蛋白(TNFRrp),也称作LT-β受体。膜型LT可能具有独特的生物学功能,特别是对正常淋巴结的发育形成可能起着重要作用。