养殖日本鳗鲡腐皮病真菌性病原的分离与鉴定

针对近年来人工养殖日本鳗鲡(Anguilla japonica)在越冬过程中广泛发生、传染速度快、死亡率高的腐皮病进行了真菌性病原的分离与鉴定。以麦粒培养法从患病鳗鲡的病灶处分离获得1株真菌菌株Js80122;通过孢子悬液背部肌肉注射、培养物创伤浸泡、孢子创伤涂抹、孢子与细菌混合注射等方法人工感染健康鳗鲡,证实了Js80122为日本鳗鲡腐皮病的病原菌。于不同培养温度条件下,以载玻片培养观察法和盖玻片插片培养观察法对Js80122进行生活史观察与形态学鉴定,结果显示Js80122为丝状真菌,菌丝无横隔,分枝发达,具无性与有性两种生殖方式,动孢子囊呈棍棒形或纺锤形,新生孢子囊以层出或聚伞状方式生长,孢子具两游现象,藏卵器中有1个以上的卵孢子,卵孢子光滑无皱缩。依据其形态学特征,鉴定Js80122为水霉科(Saprolegniaceae)、原绵霉属(Protoachlya Coker)、原绵霉(Protoachlya paradoxa)。

2株益生菌在鳗鲡消化道内的定植与演替

对鳗鲡分别人工灌喂含有益生菌A40209CDC4(枯草芽孢杆菌,Bacillus subtilis)和A31009NA(少动鞘氨醇单胞菌,Sphingomonas pauci mobilis)的饲料,于停止灌喂后的第1、2、3、4、5、7、9、15、20、30 d进行细菌的分离培养,研究试验菌株A31009NA和A40209CDC4在鳗鲡消化道内的定植与演替规律。结果显示:A40209CDC4能在鳗鲡胃内定植至少7 d,在肠道内定植至少17 d;A31009NA能在鳗鲡胃内定植至少4 d,在肠道内定植至少9 d;消化道细菌总数与益生菌数量同步变化。试验结果表明:试验用益生菌菌株A40209CDC4和A31009NA均能在鳗鲡消化道内定植,并具有从胃至肠的迁移规律;人为添加具定植能力的益生菌时,将对养殖动物消化道菌群数量产生显著影响。

福建省养殖棘胸蛙主要病害调查

通过设立固定调查点进行定期调查,并辅以门出诊和不定期巡回调查的方式,于2015至2017年对福建省部分棘胸蛙养殖场发生病害的种类、流行情况及危害程度进行调查与分析。调查结果显示,福建省养殖棘胸蛙的主要病害有17种,其中蝌蚪期的病害有10种,幼成蛙期的病害有7种。蝌蚪期危害最严重的病害是六鞭毛虫病和吸管虫病,两者的年平均发病率分别为22.5%和25.2%,年平均死亡率分别为13.1%和12.4%;幼成蛙期危害最严重的病害是歪头病,其年平均发病率和年平均死亡率分别达到16.5%和8.6%。病害的发生和死亡主要集中于夏秋高温季节,而在冬春季节,病害的发生率和死亡率均较低。通过调查,初步摸清了福建省养殖棘胸蛙病害的发生情况,为养殖生产中的病害防治工作提供了科学依据。

罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定及致病性研究

从患暴发性流行病罗非鱼的肝脏中分离获得一株细菌TL60829NA,将TL60829NA对罗非鱼进行人工感染致病性试验,试验感染罗非鱼表现出自然发病症状,确认分离菌株为罗非鱼暴发性流行病的致病菌。分离株菌经形态学观察、Bio Merieux Vitek全自动微生物分析系统GPI测定卡分析和16S rRNA特异性基因序列与NCBI中收录的其它引起罗非鱼病害的链球菌的16S rDNA序列构建的系统发育进化树显示,分离细菌与其它无乳链球菌的16S rDNA序列构成一个进化分支,而海豚链球菌则构成另一分支,确定分离菌株为无乳链球菌(Streptococcus agalaciate)。分离菌株对氨苄西林、青霉素G、卡那霉素等28种试验药物敏感,对妥布霉素、复方新诺明、环丙沙星等15种试验药物不敏感。由无乳链球菌引起的罗非鱼暴发性流行病的主要病理变化为鳃小片结构崩解,鳃上皮增生、融合;心肌纤维变性、肌间白细胞浸润;肝脏颗粒变性和脂肪变性;肠道粘膜上皮变性、坏死、脱落、固有膜炎性白细胞浸润;肾脏组织大量嗜中性白细胞浸润,肾小管上皮细胞核固缩,小动脉血管壁玻璃样变性;眼睛的脉络膜和眶骨膜组织炎性坏死,晶状体纤维断裂和脱离。

日本鳗鲡体表溃疡病病原菌的分离、鉴定及单克隆抗体制备

从日本鳗鲡(Anguilla japonica)体表溃疡病的肝脏分离到一株优势细菌JS70322NA,经人工感染证实为引起日本鳗鲡体表溃疡病的病原菌。通过形态学观察、API20E细菌鉴定试剂盒鉴定、生理生化试验和16SrRNA特异性基因分析,鉴定该菌为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。JS70322NA为典型的β-溶血,血清型为O∶9。以甲醛灭活的JS70322NA为抗原免疫Balb/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,制备出3株抗嗜水气单胞菌的单克隆抗体,分别命名为:1A5、1B8、1F3;其腹水效价分别达1.0×10-6、1.0×10-5、1.0×10-6;细胞亚型分别为IgG2a、IgM、IgG2a;3株单克隆抗体与温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)等6种水产常见致病菌无交叉反应,特异强,可应用于日本鳗鲡嗜水气单胞菌特异性检测。

养殖鳗鲡肠道益生菌的筛选

从正常养殖的鳗鲡肠道中分离得到477株细菌,通过对常见病原菌的拮抗试验和产酶能力测试筛选出47株细菌。通过对鳗鲡饲料培养基的利用能力从中筛选出19株细菌,鉴定分类后选择7株可能的益生菌进行鱼粉分解试验,筛选得到2株细菌,即A40209CDC4和A31009NA。最后测定这2株细菌对欧洲鳗鲡的毒力和对鳗鲡饲料的表观消化率。结果显示,在急性毒性试验中,试验剂量的细菌对欧洲鳗鲡无毒力,且能有效地提高对饲料的利用率,表明筛选出的2株肠道益生菌A40209CDC4和A31009NA具有良好的开发和应用前景。

养殖的日本鳗鲡肠道中细菌的数量和组成

用稀释滴种的定量方法,分别于甘露醇卵黄多黏菌素、马铃薯葡萄糖、伊红美 蓝、链球菌琼脂、CDC厌氧琼脂和营养琼脂中分离计数不同饵料投喂阶段在饱食和 空腹状态下养殖的日本鳗鲡肠道中细菌的数量和组成．结果表明:在空腹状态下,其 细菌数量约为103-107个／g;在饱食状态下约为104-108个／g．在空腹状态下其肠 道菌群组成以厌氧菌为主,其次为大肠菌群,再者为芽孢杆菌,未分离到肠球菌．在饱 食状态下其肠道菌群以厌氧菌为主,红虫投喂期其次为大肠菌群,而肠球菌占第三 位;白仔料投喂期大肠杆菌、肠球菌和芽孢杆菌的数量相当;黑仔、幼鳗、成鳗期芽孢 杆菌数量占第二,大肠杆菌数量占第三．在饱食和空腹状态下,其肠道菌群数量以红 虫投喂期的为最高,随着养殖时间的延长,肠道菌群数量下降．

双重PCR检测罗非鱼源无乳链球菌方法的建立

根据罗非鱼源无乳链球菌16SrRNA基因和sip基因序列,设计、合成2对特异性引物,通过对反应体系和反应条件优化,建立快速检测无乳链球菌的双重PCR方法。该方法扩增无乳链球菌可获得1 305bp和121bp 2个特异性片段;对6株链球菌属的菌株进行特异性分析,仅无乳链球菌能扩增出16SrRNA基因和sip基因2条特异性条带,而海豚链球菌无条带检出;经灵敏度试验,可检测到无乳链球菌菌株070717LL的最小量为1.05×102 CFU;同时,双重PCR可以检测出无乳链球菌菌株070717LL人工感染的罗非鱼脾、脑、肾组织中细菌DNA,特别是脾脏和肾脏组织的样品检测效果好。结果证明所建立的方法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点,适用于对罗非鱼源无乳链球菌病的流行病学调查。

吡喹酮和克螨特对寄生欧洲鳗鲡的拟指环虫的效果

试验结果表明,吡喹酮和克螨特是寄生在欧洲鳗鲡上的拟指环虫的有效驱除药物。新洁尔灭作为吡喹酮和克螨特复配的助溶剂,对配方的除虫效果无显著影响。驱除拟指环虫的最佳配方为吡喹酮∶克螨特∶新洁尔灭=2∶1∶1,以酒精溶解的溶液制剂能有效驱除欧洲鳗鲡寄生的拟指环虫。

复方甲苯咪唑对拟指环虫的杀灭效果和对欧洲鳗的毒性

26℃ ,2 8℃ ,30℃水温下复方甲苯咪唑对欧洲鳗的毒性试验表明 ,随水温升高、药浴时间延长、药物浓度提高 ,甲苯咪唑对欧洲鳗的毒性加强 ;复方甲苯咪唑、甲苯咪唑、左旋咪唑对拟指环虫的杀灭率表明 ,甲苯咪唑对拟指环虫具强杀灭能力 ,左旋咪唑对拟指环虫无杀灭能力 。

欧洲鳗病原菌控菌药物的研究

应用药敏纸片法测定 2 4种抗菌药物对欧洲鳗致病菌 :非 0 1群霍乱弧菌、温和气单胞菌、鲁氏不动杆菌、迟钝爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的敏感性。其中 ,诺氟沙星、四环素、头孢三嗪、庆大霉素、头孢噻肟抑菌能力较强。最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度 (MBC)测定结果表明 ,头孢三嗪对病原菌杀灭能力强 ,复方新诺明、硫酸庆大霉素对病原菌抑制及杀灭能力差 ,联合药敏试验结果表明敏感药物联合后对病原菌的杀灭能力加强。

草鱼致病性类志贺邻单胞菌的分子鉴定及快速检测

应用原核生物16SrRNA基因通用引物对草鱼致病菌株LCCiL90625NA进行16SrRNA基因的克隆、序列分析。核酸序列同源性分析表明,该序列与Plesiomonas shigelloides菌株PIC3的16SrRNA基因序列(NCBI登录号:GQ359957)同源性最高,为99.7%。同时,通过与弧菌科代表菌株16SrRNA基因构建的发育进化树表明,该菌株与已登录的类志贺邻单胞菌聚为一类。设计引物扩增Plesiomonas shigelloides 23SrRNA基因的特异性片段进一步证实分离菌株为类志贺邻单胞菌,同时证明该引物可以用于类志贺邻单胞菌的快速检测。

养殖欧洲鳗鲡肠道菌群组成的研究

用稀释滴种定量方法,分别于甘露醇卵黄多黏菌素、马铃薯葡萄糖、伊红美蓝、链球菌琼脂、CDC厌氧琼脂和营养琼脂,分离并计数不同饵料投喂阶段饱食和空腹状态下养殖欧洲鳗鲡肠道细菌的数量与组成。结果表明:在空腹状态下肠道菌群组成以大肠菌群为主,未开口期和水蚯蚓(Tubificidae)投喂期厌氧菌第二,其次为芽孢杆菌;投喂人工配合饲料后芽孢杆菌第二;投喂人工配合饲料后出现肠球菌。饱食状态下以厌氧菌为主,其次为大肠菌群,水蚯蚓投喂期间肠球菌占第三位,其余时间芽孢杆菌占第三位。饱食和空腹状态下,肠道菌群数量以水蚯蚓(Tubificidae)投喂期最高,随养殖时间的延长,肠道菌群数量下降。

欧洲鳗鲡肝肾病病原菌的分离与鉴定

患肝肾病的养殖欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)出现肝、肾肿大,且肝脏具白色溃疡灶的症状。从肝脏中分离、纯化到优势细菌,定名AL60306NA1。人工感染试验证实:向欧洲鳗鲡腹腔内注射1.0×108cfu/mL菌株悬液,实验鱼死亡率达100.0%;注射1.0×107cfu/mL,死亡率为60.0%;形态学观察、API20E细菌鉴定试剂盒鉴定实验证明菌株AL60306NA1有动力、拥有革兰氏反应阴性、氧化酶阴性、H2O2酶阳性、兼性厌氧、发酵葡萄糖产酸产气、不发酵蔗糖和蜜二糖及L一阿拉伯糖、赖氨酸脱羧酶阳性、柠檬酸盐弱阳性、产生硫化氢和吲哚、MR阳性和典型的β-溶血等特征;16S rRNA特异性基因分析鉴定实验说明克隆的AL60306NA1 16S rRNA基因部份序列为1507bp、与迟缓爱德华氏菌(AB050829.1)的同源性达99.7%。综合上述结果,确定该菌株为养殖欧洲鳗鲡肝肾病的病原菌,并鉴定为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)野生型。用菌株AL60306NA1感染小白鼠实验测定该菌对小白鼠的LD50为7.1×105cfu/mL,同时自该菌株PCR扩增到长度约1000bp的溶血素基因特异性片段,结果表明菌株AL60306NA1有一定的致病力。

美洲鳗鲡对水温、盐度和pH值的耐受性试验

美洲鳗鲡Ａｎｇｕｉｌａｒｏｓｔｒａｔａ，对水温、盐度、ｐＨ值的耐受性试验，结果表明：适宜水温为１５．０～３１．０℃，临界上限水温为３７．０℃，临界下限水温为１．５℃；适宜盐度为０～１．５％，临界极限为３％；适宜ｐＨ值为３５～９５，临界上限ｐＨ值为１１０，临界下限ｐＨ值为２５。

吡喹酮和克螨特对欧洲鳗鲡血液指标的影响

以复配试剂及组成成分吡喹酮和克螨特浸浴欧洲鳗鲡(Anguillaanguilla),分别测定浸浴12、36、45h及换水后12、36、67h鳗鲡血液中红细胞数、白细胞数、血小板数等血常规指标及丙氨酸氨基转移酶、肌酐、胆碱脂酶、天门冬氨酸氨基转移酶、血清血尿素氮生化指标。测试结果表明:同一取样时间,不同药物处理组及对照组相互间绝大部分指标差异不显著。在有效驱虫浓度范围内,复配试剂对欧洲鳗鲡内脏器官及生理机能未产生严重损害,对鳗鲡是安全的。

嗜水气单胞菌控菌药物配方的筛选

应用药敏纸片法测定63种抗菌药物对ML316、B-Ah6、TPS30、9617、YT-1、YT-715、ZY00-1、CQ-1、CHS-2、HB-04、JXO1-1、A.h1、A.h标准株、B-2、ATCC7966、0081、0030、JS70322NA等18株嗜水气单胞菌的敏感性,选择敏感药物硫酸庆大霉素、硫酸阿米卡星、硫酸新霉素、盐酸米诺环素、硫酸链霉素测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。结果显示：MIC≤12.5 mg/L的药物,硫酸新霉素占61.11%,盐酸米诺环素占94.44%,硫酸庆大霉素占72.22%;MBC≤25mg/L的药物,硫酸新霉素占50%,盐酸米诺环素占72.22%,硫酸庆大霉素占55.56%,优于硫酸阿米卡星、硫酸链霉素,但硫酸庆大霉素均匀度不佳,因而硫酸新霉素、盐酸米诺环素对实验菌株抑制和杀灭能力较强;硫酸新霉素、盐酸米诺环素与增效剂甲氧苄氨嘧啶（TMP）分别以8∶2∶1和9∶1∶1比例混合配伍,加入TMP对实验菌株的MIC和MBC值较不加TMP显著下降,MIC值提高66.67%,MBC值则提高96.67%。综合原料成本,以硫酸新霉素、盐酸米诺环素与TMP比例分别为9∶1∶1为配方药物,制作药物饲料,以健康锦鲤和JS70322NA菌株为对象,开展预防和治疗临床评价实验,结果显示：配方药物具有良好的预防和治疗效果,实验组鱼体表症状不明显、临床预防和治疗实验各梯度给药剂量的死亡率均比对照组下降40%~60%。

水蚯蚓的消毒试验

采用食盐水刺激吐脏、消毒剂杀菌、抗菌抑菌药物抑菌效果的研究 ,探讨水蚯蚓的处理方法 .盐度 4.2～ 7.5的食盐水处理 40～ 6 0min刺激吐脏效果较佳 ;消毒剂杀菌效果显著 ,二氧化氯最佳 ,其次为高锰酸钾 ,再者为含氯消毒剂 ;抗菌抑菌药物均具良好的抑菌效果 ,但不同药品的抑菌效果存在着较大差异 .

蛙类脑膜脓毒性伊丽莎白菌多克隆抗体的制备及应用

【目的】制备蛙类脑膜脓毒性伊丽莎白菌多克隆抗体,建立间接ELISA检测方法,进行病原菌在宿主体内的示踪研究,为病原菌的致病机理研究奠定基础。【方法】将分离自患歪头病的棘胸蛙的脑膜脓毒性伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningosepticum)RsB1151018NA甲醛灭活后,免疫新西兰大白兔制备兔抗血清。通过优化反应条件,建立脑膜脓毒性伊丽莎白菌间接ELISA的检测方法;兔抗血清多克隆抗体采用Protein A亲和层析柱分离纯化,以异硫氰酸荧光素(FITC)标记,标记后的抗体与感染RsB1151018NA的棘胸蛙不同脏器组织的冷冻切片反应,荧光显微镜观察,跟踪RsB1151018NA在棘胸蛙体内的迁移。【结果】试验结果表明,制备的兔抗棘胸蛙脑膜脓毒性伊丽莎白菌多克隆抗体血清效价为1∶5.12×10^(5),纯化后的抗体效价为1∶1.6×10^(4),且建立的间接ELISA方法检测脑膜脓毒性伊丽莎白菌具有高度特异性,与其他水产常见病原菌没有交叉反应,检测灵敏度为1.0×10^(4) CFU·mL^(-1)。脑膜脓毒性伊丽莎白菌在棘胸蛙体内随血液循环而分布至全身,可侵袭肌肉、肝脏、肾脏、脾脏、肠道、心脏、眼和脑等组织器官,肾脏、眼和脑感染程度最严重,推测这三个组织器官是其靶器官;创伤感染是可能的感染途径之一。【结论】建立的检测方法能够快速、灵敏、特异地检测脑膜脓毒性伊丽莎白菌,对蛙类歪头病的防控和早期诊断可提供理论参考依据;另外利用免疫荧光检测病原菌在宿主体内的迁移,研究病原的致病机理及发病过程等,能为防治药物的研发和防治方法的确定提供理论依据。