职业苯接触工人外周血T-bet和GATA-3表达变化的特点

目的:了解职业苯接触及慢性苯中毒工人外周血中T细胞特异性转录因子T-bet和GATA-3mRNA表达情况。方法:利用SYBR Green I实时荧光定量PCR分别检测20例正常人、25例职业苯接触工人和27例慢性苯中毒工人外周血单个核细胞T-bet和GATA-3 mRNA表达情况。结果:在职业接触苯工人组及慢性苯中毒工人组,多数样本表现为GATA-3表达上升和T-bet表达下降,而少数病人则表现为相反的模式。GATA-3在正常人的表达水平为0.39±0.22,与正常组对照比较职业接触苯工人组中有19例GATA-3表达水平呈上升趋势(0.57±0.54),慢性苯中毒工人组中则有20例GATA-3表达水平呈上升趋势(0.52±0.50)。此外,在职业接触苯工人组中发现6例GATA-3表达水平显著下降(0.15±0.12,P<0.05),同样在慢性苯中毒工人组中也有7例GATA-3表达水平显著下降(0.07±0.06,P<0.05)。T-bet在正常人的表达水平为2.15±1.45,与正常组对照比较职业接触苯工人组中有19例T-bet表达水平呈下降趋势(1.91±1.49),慢性苯中毒工人组中T-bet表达水平均呈下降趋势(1.52±0.56)。此外,在职业接触苯工人组中也可发现6例T-bet表达水平显著上升(3.19±2.10,P<0.05)。结论:职业苯接触及慢性苯中毒影响工人外周血中T细胞特异性转录因子T-bet和GATA-3mRNA表达水平。

2型糖尿病视网膜病变患者外周血单个核细胞中PEDF与TNF-α水平的变化

目的：色素上皮衍生因子（PEDF）是影响糖尿病视网膜病变（DR）发生发展的重要因子，本研究观察2型糖尿病视网膜病变患者外周血单个核细胞（PBMCs）中PEDF、磷酸化NF-κB p65及TNF-α的表达，探讨DR的发病机制。方法：选取2011年10月-2013年4月在我院内分泌科住院确诊为2型糖尿病的患者（DM组）108例，并根据眼底造影结果将患者分为无糖尿病视网膜病变组（NDR组）52例和糖尿病视网膜病变组（DR组）56例，同期糖耐量实验正常者52例作为对照组（NC组）。密度梯度离心法收集患者PBMCs，提取总蛋白，Western blotting检测3组患者PBMCs中PEDF、磷酸化NF—κB p65和TNF-α蛋白表达水平，ELISA测定血浆PEDF与TNF-α水平，收集患者体检指标并测量患者生化指标。结果：Western blotting检测结果显示NDR组和DR组PEDF、磷酸化NF-κB p65和TNF—α蛋白水平明显高于NC组（P〈0．05）；DR组TNF-α蛋白水平明显高于NDR组（P〈0．05），DR组PEDF及磷酸化NF—κB p65蛋白水平略高于NDR组，差异无统计学意义（P〉0．05）；NDR组和DR组血浆PEDF与TNF—α水平均明显高于NC组（P〈0．05），DR组明显高于NDR组（P〈0．05）。在糖尿病组，血浆PEDF水平与TNF-α及血尿酸水平呈正相关（r=0．39，r=0．25，P〈0．05）。结论：本研究首次证实PBMCs中可表达PEDF；2型糖尿病患者PBMCs中PEDF表达水平增加，TNF—α及血浆PEDF的表达水平上调，PEDF可能通过与炎症因子TNF-α相互作用影响DR发生发展。

GLP-1受体激动剂对肥胖小鼠脂肪组织的脂解作用及机制探讨

目的:探讨胰高血糖素样肽1(GLP-1)受体激动剂艾塞那肽(exendin-4)对肥胖小鼠脂肪组织的作用及机制。方法:8周龄C57BL/6J小鼠高脂喂养12周后随机分为艾塞那肽组和生理盐水对照组,另设正常饮食组。取附睾旁脂肪检测sirtuin 1(SIRT1)、脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及脂联素mRNA的表达。Exendin-4或联合SIRT1激动剂/抑制剂处理3T3-L1脂肪细胞24 h;小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)诱导成脂肪细胞后exendin-4干预24 h;检测SIRT1、ATGL和激素敏感性脂酶(HSL)的蛋白表达水平。结果:与生理盐水对照组相比,艾塞那肽组小鼠附睾旁脂肪量、空腹血糖及血甘油三酯水平降低(均P<0.05),体重减轻,血TNF-α水平降低。艾塞那肽干预后,肥胖小鼠脂肪组织SIRT1、ATGL和脂联素mRNA表达明显上调,TNF-αmRNA表达明显下调(P<0.05)。Exendin-4剂量依赖性促进3T3-L1脂肪细胞SIRT1、ATGL和HSL脂解相关蛋白的表达。联合SIRT1激动剂后,脂滴数量减少,上述脂解相关蛋白的表达上调。联合SIRT1抑制剂后上述作用减弱。敲除SIRT1后MEF脂肪细胞内脂滴增大,数量增多,exendin-4促进脂解的作用消失。结论:艾塞那肽通过激活SIRT1促进肥胖小鼠脂肪组织脂解作用。

人溶菌酶N端与Exendin-4嵌合蛋白的基因克隆及原核表达

目的:克隆嵌合多肽人溶菌酶N端-Exendin-4基因并进行原核表达和纯化。方法:通过重组PCR技术将人溶菌酶N端74个氨基酸的基因序列与Exendin-4多肽基因序列相连接,其间引入一段由凝血酶和二肽基肽酶识别位点组成的连接序列。以嵌合基因hLYZ(N74)-Ex4与质粒pET-32a(+)构建原核表达体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达。表达蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化、Western blotting鉴定;透析复性后,以肠激酶切割并回收目的多肽。结果:重组质粒pET-32a/hLYZ(N74)-Ex4构建正确,目的蛋白主要以包涵体形式存在,37℃诱导4h、IPTG浓度为0.6 mmol/L时表达量最高,约占菌体蛋白总量的30%。Western blotting检测显示重组蛋白为单一清晰条带。重组蛋白经肠激酶切割后,回收得到高纯度的嵌合多肽。结论:成功构建hLYZ(N74)-Ex4嵌合基因的原核表达质粒,高效原核表达并获得高纯度目的蛋白。

LncRNA-PVT1在巨噬细胞炎症反应中的表达及与炎症基因相关性研究

目的:研究长链非编码RNA(LncRNA)PVT1在LPS诱导THP-1源巨噬细胞炎症反应中的表达及其与炎症基因表达相关性,推测lncRNA-PVT1在脓毒症急性肺损伤炎症反应中的可能作用。方法:通过LPS刺激THP-1源巨噬细胞产生炎症反应造模,利用RT-qPCR检测,比较不同刺激浓度(0、0.5、5.0μg/ml,8 h)下各组细胞中lncRNA-PVT1及TNF-α、IL-1βmRNA表达情况。结果:与对照组相比,IL-1β及TNF-αmRNA在LPS不同刺激浓度下,均表达上调,且具有统计学差异(均P<0.05)。随着刺激浓度增加,IL-1β及TNF-αmRNA表达量上升,呈浓度依赖,在LPS 5.0μg/ml作用8 h下,IL-1β及TNF-αmRNA表达量达峰值。与对照组相比,在5.0μg/ml LPS组中ln-cRNA-PVT1表达明显上调,具有统计学差异(P<0.0001)。相关性分析发现5μg/ml LPS刺激8 h后,THP-1源巨噬细胞中lncRNA-PVT1相对表达量分别与IL-1β及TNF-αmRNA相对表达水平呈正相关(分别为R^2<0.6134,P=0.0125;R^2<0.7825,P=0.0015)。结论:LncRNA-PVT1在LPS致THP-1源巨噬细胞炎症反应中高表达,且与TNF-α及IL-1βmRNA表达呈正相关,提示该lncRNA-PVT1在脓毒症急性肺损伤炎症反应中可能起重要作用。