烟草香气相关基因CRISPR/Cas9编辑突变体库的构建

为探究CRISPR/Cas9基因编辑技术构建烟草突变体库的可行性,该研究以烤烟品种‘红花大金元’为实验材料筛选了100个可能参与烟草香气代谢的基因,设计相应的100个sgRNA并构建了由100个CRISPR/Cas9编辑载体组成的质粒库,获得转基因材料后分析了载体的共转化率、靶向编辑率和脱靶编辑情况。结果表明:(1)通过农杆菌介导100个sgRNA的共转化后,在172个阳性转化株中检测到了其中的77个sgRNA,共转化率为77%。(2)在77个携带sgRNA的转基因后代中,69个sgRNA对目标基因进行了靶向编辑,编辑率为89.6%。(3)脱靶位点测序检测发现,只有1个sgRNA在非目标靶位点产生了脱靶编辑,表明CRISPR/Cas9基因编辑技术在烟草中的脱靶概率非常低。综上所述,利用CRISPR/Cas9载体库共转化对烟草基因进行高通量靶向编辑以构建突变体库的方法切实可行,并且该方法有共转化率高、编辑率高和脱靶编辑概率低等特点。

普通烟草SWEET基因家族的鉴定与表达分析

【目的】为挖掘参与烟草糖代谢的SWEET(sugar will eventually be exported transported)基因家族成员。【方法】以拟南芥SWEET蛋白为参考,利用生物信息学方法,对栽培烟草的SWEET蛋白家族进行鉴定,分析蛋白理化性质、系统进化、染色体定位、基因结构和顺式作用元件,对其在不同组织和不同胁迫处理的表达模式进行检测。【结果】从普通烟草中鉴定到70个可能的SWEET基因,系统发育树将其划分为4个亚家族,大多数烟草SWEET基因在进化过程中经历纯化选择。不同烟草组织的表达模式分析显示,一些烟草SWEET基因具有组织表达特异性。不同胁迫处理的表达模式分析显示,部分烟草SWEET基因在葡萄糖、蔗糖、低温、干旱或者是盐胁迫处理下表达量变化明显。【结论】Ntab0097340和Ntab0727890是烟草植株重要的响应干旱与低温胁迫的基因,本研究为深入研究烟草SWEET基因功能提供有价值的参考信息。

固相萃取净化-离子色谱法测定不同生长期新鲜烟叶中的7种无机阴离子

为了研究不同生长期新鲜烟叶中无机阴离子的含量和变化规律,建立了一种固相萃取净化-离子色谱法测定新鲜烟叶中的,7种无机阴离子(F^(-)、Cl^(-)、Br^(-)、NO_(2)^(-)、NO_(3)^(-)、SO_(4)^(2-)、PO_(4)^(3-))的方法。样品经0.1 mol/L NaOH水溶液超声提取,萃取液经RP1.0cc固相萃取柱净化后,使用AS11-HC(4 mm×250 mm)色谱柱进行分离,以KOH为流动相,梯度洗脱。结果表明,7种无机阴离子在0.10~5.0μg/mL范围内具有较好的线性(r>0.996),检出限在0.01~0.04μg/mL,定量限在0.04~0.14μg/mL,加标回收率为96.3%~102%,相对标准偏差(RSD)在2.7%~4.8%。方法前处理操作简单,7种无机阴离子分离好,检测灵敏准确,可用于不同生长时期新鲜烟叶样品中多种无机阴离子含量的检测分析。

离子色谱法测定不同生长期烟叶中的5种阳离子

【目的】研究不同生长期烟叶中阳离子含量的变化规律。【方法】新鲜烟叶样品以0.05 mol/L盐酸水溶液(HCl)为提取溶剂,经RP 1.0cc固相萃取柱净化,采用梯度淋洗程序,基于离子色谱法对不同生长期烟叶中的NH_(4)^(+)、K^(+)、Na^(+)、Ca^(2+)、Mg^(2+)进行定量分析。【结果】(1)该方法中5种阳离子在1~100 mg/mL范围内具有较好的线性相关性,其检出限在0.01~0.07 mg/mL之间,平均加标回收率在96.9%~101.2%之间,相对标准偏差均在6%以内。(2)5种阳离子的含量在不同生长时期有明显差异:K+与NH4+在苗期时含量最高,成熟期时含量最低;Na^(+)在苗期时含量相对较高,现蕾期与成熟期的含量无显著性差异;Mg2+在苗期时含量较低,现蕾期与成熟期时含量升高,且无显著性差异;Ca^(2+)在苗期时含量较低,现蕾期与成熟期含量显著增加。【结论】不同生长期的烟叶中,各阳离子的变化规律差异较大,研究结果可为后续烟叶品质与内在阳离子含量的关联分析提供技术支撑和数据积累。

CHO细胞初始接种密度对细胞毒性试验结果的影响

考察了CHO细胞初始接种密度对体外细胞毒性试验结果的影响。通过细胞倍增试验检测不同初始接种密度下CHO细胞倍增时间的差异,并分别采用中性红比色法及MTT比色法检测CHO细胞初始接种密度对细胞毒性试验结果的影响。结果表明,CHO细胞初始接种密度对细胞毒性试验的结果存在一定影响:以2×104～6×104个·mL-1为细胞初始接种密度,CHO细胞在48h内生长速度较为稳定;以4×104～6×104个·mL-1为细胞初始接种密度,中性红比色法毒性试验结果较为稳定;以2×104～4×104个·mL-1为细胞初始接种密度,MTT比色法细胞毒性试验结果较为稳定。在不同的细胞毒性试验中选择适合的细胞初始接种密度有助于提高细胞毒性试验结果的可重复性。

FEMA对食用香料物质进行安全性评估概述

文章综述介绍了FEMA GRAS名单的产生和由来、FEMA专家小组评估的对象、FEMA GRAS评估的四大要素、申请FEMA GRAS评估所需的数据以及FEMA GRAS基于化学组的评估方法。着重阐述了FEMA对食用香料物质进行GRAS评估时需要考虑的四大要素。包括:进行安全评估的专家必须是具有资格的权威科学家;评估应按照科学程序或1958年1月1日之前在食品中普遍使用原则进行;评估在预期的使用条件下进行;评估结果须得到普遍认同。

细胞毒性试验多孔平行数据异常值检验方法的比较

为了选取适合于对细胞毒性试验数据的异常值进行检验的方法、提高检测数据的可靠性,对常用的5种异常值检验方法的计算方法及判定原则进行了比较研究,并运用这5种异常值检验方法对同一组细胞毒性试验数据进行了分析。结果发现,拉依达准则计算简便,适合样本量较大时对异常值进行初筛;样本量较小时适合选取狄克逊准则、罗马诺夫斯基准则对数据中的异常值进行判定;从计算方法来看,肖维勒准则、格拉布斯准则、罗马诺夫斯基准则相似;对数据中异常值进行检出时,罗马诺夫斯基准则最为严格,肖维勒准则次之;狄克逊准则较适合于对多个异常值进行逐个检出。细胞毒性试验多孔平行数据属于小样本量数据,待检出的异常值不仅限于1个,选用狄克逊准则对细胞毒性试验多孔平行数据进行检验较为适宜。

体外连续传代培养对生物工程细胞CHO凋亡的影响

采用Annexin V-FITC/PI双染法检测磷脂酰丝氨酸外翻、JC-1染色法检测线粒体膜电位、底物切割法检测Caspase-3及Caspase-8酶活性等4个指标来评估连续传代培养的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的凋亡情况。结果表明,随着连续传代培养代次的增加,CHO细胞发生内部凋亡途径介导的凋亡,同时对凋亡诱导剂的反应更为敏感。因此,可以采用凋亡指标来监测细胞状态,从而提高基因工程蛋白的生产效率及化学品毒理学评价的准确性。

高效液相色谱串联质谱法快速测定烟草中5种甾醇的研究

本研究基于自主设计的集萃取、过滤和转移功能为一体的样品萃取瓶,建立了高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)快速测定烟草中麦角甾醇、胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法。样品在萃取瓶中经水解、皂化和萃取,经LC-MS/MS进行分析检测。结果表明:自主设计的样品萃取瓶可提高前处理效率,5种甾醇在0.1~150 ng·mL^-1内均具有良好的线性关系(线性相关系数>0.999);检出限在0.015~0.075ng·mL^-1;平均回收率在93.4%~103.8%之间,日内精密度和日间精密度均小于3.5%,具有较好的重复性。该方法能够满足烟草中5种甾醇快速、准确测定。

毒理学关注阈值(TTC)方法的历史演化与发展

毒理学关注阈值(TTC)的概念是指,对化学品建立一个人体暴露阈值,当低于该阈值时化学品对人体健康无明显的风险。TTC方法从提出至今已将近半个世纪,并经历了一个不断完善和发展的过程。本文主要从TTC方法的建立、发展、改进等方面进行了探讨。TTC方法最初被用于食品接触材料中安全阈值的确定。之后,人们对经口的非致癌毒性终点的无明显作用剂量(NOEL)进行了分析,发展出了以结构类为基础的多层次TTC方法。这种以结构类为基础的多层次TTC方法后来被联合国粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)食品添加剂联合专家委员会(JECFA)和欧洲食品安全局(EFSA)等组织所采用,并在此基础上进行了发展和改进。TTC方法现已经在低人体暴露水平的化学物质风险评估中得到了广泛的应用,避免了大量不必要的,过于详细的研究,以及广泛的毒理学实验。TTC方法也为那些用量极低并且缺乏完整毒性数据的化学物质的风险评估提供了一条可行的途径。

基于非靶向代谢组学的红花大金元不同生育期烟叶代谢图谱差异分析

【目的】为分析不同生育期烟草烟叶代谢图谱差异。【方法】以烟草品种红花大金元为研究对象,采集团棵期、现蕾期和成熟期烟叶样品,利用LC-QTOF/MS进行代谢指纹图谱检测,利用统计分析方法对差异代谢物进行筛选,基于Spearman相关分析计算代谢物之间的相关性系数,利用MetaboAnalyst软件进行代谢通路富集分析。【结果】(1)不同生育期烟草样品代谢图谱存在明显差异,共鉴定出245个差异代谢物,其中类黄酮、有机酸、氨基酸、核苷、生物碱、脂类等物质种类最多。(2)烟碱及其衍生物,如烟碱-1-氧代、麦斯明、假木贼碱、马钱子碱、新烟碱、2,3'-二联吡啶,均随烟草生育期而逐渐累积,而与烟碱合成相关的前体物质,如精氨酸、亚精胺、腐胺、羟基丁酸等,均随着生育进程逐渐减少,且与烟碱含量显著负相关。(3)与次级代谢物合成相关氨基酸和有机酸等物质在团棵期或现蕾期含量较多,而在成熟期含量较低,与成熟期次级代谢物合成有关。(4)大部分类黄酮和酚酸组分在成熟期时含量较高,可以提高烟草抗病和抗逆能力。(5)相关性分析发现,烟碱含量与谷氨酸、泛酸、吡哆醛、蜜二糖、3-羟基邻氨基苯甲酸和顺式玉米素-o-葡萄糖苷等物质显著正相关,可能是调控烟叶中烟碱含量的重要标志物。【结论】基于代谢组学揭示了不同生育期烟草代谢物变化规律,为优质烟草育种及品质分析提供技术支撑。

迷迭香有效成分的提取方法综述

对水蒸汽蒸馏法、溶剂提取法、超声提取法、超临界二氧化碳提取法、亚临界流体萃取法和微波萃取法等,提取迷迭香进行了综述。

新品种烟叶烟气危害性指数分析研究

【目的】分析烤烟新品种烟叶的危害性指数,为卷烟开发提供数据参考。【方法】通过烟草行业标准分析方法,对38个新品种烟叶烟气常规化学成分(焦油、烟气水分和烟碱)和7项烟气成分(NH3、HCN、苯酚、巴豆醛、B[a]P、NNK和CO)进行分析及计算,得到其烟气危害性指数(H值)。【结果】29个新品种烟叶的烟气焦油量均小于11 mg/支,30个新品种的烟碱含量处于0.9～1.2 mg/支,符合卷烟工业的需求;33个样品的H值小于烟草行业卷烟产品的平均值(8.60),能满足卷烟工业的需求;15个新品种烟叶样品的H值小于8.00,可用于开发低危害卷烟。【结论】大部分烤烟新品种烟叶的烟碱含量、烟气焦油量及H值均符合卷烟工业开发的需求。

电子烟烟气捕集液对CHO细胞相对增殖率的影响

参照加拿大Labstat的电子烟抽吸模式,抽吸100口电子烟,用细胞培养基捕集电子烟烟气,通过MTT法研究电子烟烟气对CHO细胞相对增殖率的影响。结果表明:在该抽吸模式下,抽吸100口电子烟产生的烟气捕集液与CHO细胞相对增殖率之间存在浓度梯度效应;抽吸一支3R4F产生的烟气捕集液对CHO细胞相对增殖率的影响明显高于抽吸100口电子烟所产生烟气的影响,在100%烟气浓度下,电子烟烟气捕集液对CHO细胞的相对增殖率是3R4F的10倍以上。

超高效液相色谱-串联质谱测定卷烟爆珠中7种着色剂

为检测卷烟爆珠中7种水溶性着色剂含量,建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS-MS)同时分析爆珠中柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、赤藓红、诱惑红、亮蓝含量的检测方法。爆珠样品用水匀浆提取,再用正己烷除去有机杂质,水相经0.22μm滤膜过滤后进样分析。以WatersBEH色谱柱为分析柱,甲醇和10mmol/L乙酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱,采用超高效液相色谱-串联质谱在正负两种电离模式下多反应监测模式(MRM)分析,外标法定量。7种着色剂的线性范围介于0.005~0.5μg/mL,相关系数均大于0.99,3个水平加标平均回收率为85.2%~105%,相对标准偏差为2.1%~4.6%,方法定量限在0.4~5.0μg/g。该方法灵敏、准确,适用于爆珠中7种着色剂的含量分析。

超高效液相色谱–串联质谱法测定卷烟中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖

建立超高效液相色谱–串联质谱法测定卷烟中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖4种水溶性糖的含量。样品用水超声提取,稀释过滤后直接进样,以Acquity BEH Amide色谱柱为分析柱,乙腈和水为流动相,梯度洗脱,采用负离子多反应监测模式分析。果糖和葡萄糖的线性范围为2.5～30μg/mL,蔗糖和麦芽糖的线性范围为0.25～3μg/mL,线性相关系数均大于0.997,方法检出限均为0.03 mg/g。加标样品的平均回收率为93.6%～101.0%,测定结果的相对标准偏差为0.7%～2.9%(n=6)。该方法简便、快速,可用于卷烟样品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的测定。

云南产卷烟中游离氨基酸含量分析

为明确云南产卷烟中游离氨基酸的含量特征,分析了40仹云南产卷烟样品中的19种游离氨基酸含量。结果表明:云南产卷烟的脯氨酸含量最高,达2 270.55μg/g,天冬氨酸含量为220.98μg/g,苯丙氨酸含量为144.03μg/g;谷氨酰胺、缬氨酸、色氨酸、组氨酸、谷氨酸、酪氨酸、胱氨酸、丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、苏氨酸和丝氨酸含量为10.59～81.37μg/g,异亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺和甘氨酸含量均低于10μg/g。除赖氨酸与其他氨基酸不相关外,其余氨基酸之间均存在中等程度或高度相关性。对卷烟品质贡献较大的有酪氨酸、组氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、缬氨酸和脯氨酸。40仹卷烟样品可聚为3类,聚类结果与样品实际品质较为吻合。

水蒸气蒸馏分离-气相色谱/质谱法测定烟用香精和料液中的防腐剂

建立了水蒸气蒸馏分离-气相色谱/质谱法(GC-MS)测定烟用香精和料液中的防腐剂的方法.方法利用水蒸气蒸馏(110℃,5 m L/min流量,收集22 min,馏分90~95 m L)进行目标物质分离,并利用Oasis HLB反相固相萃取柱进行溶剂转换及样品再净化,萃取柱利用5 m L甲醇进行淋洗;滤液利用优化后的GC-MS法,选择离子模式进行检测;利用该方法,6种目标物质在0.2~120μg/m L范围内具有较好的线性(r>0.999),检出限在0.023~0.080μg/m L之间,定量限在0.070~0.25μg/m L之间,日间和日内精密度均小于5%,不同加标水平下,平均回收率在93%~103%之间.该方法广谱性强,灵敏度高,线性相关性好,重复性佳,可以满足烟用香料中防腐剂的检测及风险监控要求.

云产卷烟中4种水溶性糖含量及其与品质的关系

为明确云产卷烟中4种水溶性糖的含量特征,采用液相色谱蒸发光散射检测器分析了4类40份云产卷烟样品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖4种水溶性糖含量。结果表明,卷烟样品中4种水溶性糖含量均值由高到低依次为果糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖,含量均值分别为11.99%、7.95%、1.52%、1.32%,变异系数分别为10.52%、17.38%、19.40%、19.00%;其中果糖和葡萄糖含量较高,蔗糖和麦芽糖含量相对较低,且差别不大。4种水溶性糖中,葡萄糖与果糖、蔗糖含量呈现高度正相关,相关系数分别为0.899和0.642。4类卷烟中,葡萄糖、果糖和蔗糖含量从四类烟到二类烟依次升高,到一类烟又略有降低;麦芽糖含量则从四类烟到一类烟依次降低。

G蛋白偶联受体家族味觉受体的信号转导及应用研究进展

味觉是口中的物质与味觉受体细胞发生反应而产生的一种感觉。当呈味物质刺激味觉受体时,信号通过神经感觉系统传导到大脑,经过综合神经中枢系统的分析,从而产生味觉。近年来味觉受体、信号转导及应用研究引起了极大的关注,对细胞的大量研究结果表明不同的味觉通过不同的味觉受体产生。本文就G蛋白偶联受体(guanosine-binding protein coupled receptor,GPCR)家族味觉受体的信号转导过程及应用研究的进展进行综述。