基于CRISPR系统的双孢蘑菇基因编辑体系建立及应用

根据CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)基因编辑技术,设计AbPPO4特异性导向RNA,构建双孢蘑菇(Agaricus bisporus)基因编辑载体pAbGEB1-AbPPO4,再通过农杆菌介导转化双孢蘑菇菌丝体建立基因编辑体系,观察菌丝生长状况。结果表明:获得12株转化子,1号和7号的菌丝体中存在潮霉素抗性基因,且AbPPO4基因的相对表达量较低,分别为0.28±0.04和0.47±0.02,与对照组相比,组间差异均具有统计学意义(P<0.05),说明1号和7号转化子的菌丝体AbPPO4基因表达受到了抑制;与对照组相比,1号和7号转化子的菌丝体中AbPPO4基因均发生了突变,1号和7号分别产生了4 bp和11 bp的碱基缺失,证明设计的CRISPR/Cas9系统在双孢蘑菇内对AbPPO4基因成功地进行了编辑;同时发现AbPPO4基因突变后对双孢蘑菇菌丝体的生长产生了不利影响。

高粱品种BTx623原生质体分离及瞬时表达体系的建立

高粱(Sorghum bicolor)是世界上仅次于小麦、水稻、玉米和大麦的重要粮食作物之一,虽然高粱基因组已经完成了测序,但是针对高粱测序品种BTx623,遗传转化方法的缺乏限制了高粱遗传育种和功能基因组研究的发展。而原生质体瞬时表达技术,则因为其高效、快速的特性,在功能基因组研究中具有重要的作用。为了在高粱品种BTx623中建立原生质体瞬时表达体系,本研究以BTx623幼苗为材料,对原生质体分离过程中的渗透压、酶液成分、酶解时间进行研究。结果表明:BTx623幼苗的原生质体分离过程中,最佳酶解液组成为1%纤维素酶、0.25%离析酶、0.6 mol/L甘露醇、10 mmol/L吗啉乙烷磺酸、1 mmol/L CaCl2、0.1%小牛血清蛋白和5 mmol/Lβ⁃巯基乙醇,并获得了每毫升1×10^(7)个的高质量原生质体,所获原生质体活性在90%以上。之后利用PEG介导的转化方法,将含有35S::egfp的质粒导入到原生质体中,并通过荧光显微观察统计,遗传转化率达到(61.31±3.91)%。本研究通过优化高粱品种BTx623原生质体制备及瞬时转化的条件,成功建立了其原生质体瞬时表达体系,为进一步开展高粱品种BTx623功能基因组的研究奠定了基础。

红颜草莓叶盘再生及遗传转化体系的优化

草莓离体组织再生和遗传转化体系的研究对草莓分子育种至关重要。为了优化农杆菌介导草莓品种红颜(Fragaria×ananassa Duch.Benihoppe)的遗传转化体系,本研究以红颜草莓组培苗的离体叶盘作为试验材料,首先确定了其离体再生的最佳条件,对影响转化效率的因素进行优化,获得了稳定高效的再生及转化体系。结果表明,红颜草莓离体叶盘最佳暗培养时间为9 d,最佳愈伤诱导培养基为MS+TDZ(2.0 mg/L)+IBA(0.1 mg/L)+2,4-D(0.1 mg/L),最佳愈伤分化培养基为MS+6-BA(0.5 mg/L)+NAA(0.1 mg/L),转化体系的最佳组合为预培养2 d、添加300μmol/L的AS、以OD600nm=0.6的EHA105型的农杆菌浸染5 min、共培养5 d。经优化后的红颜草莓叶盘再生及遗传转化体系对该品种的进一步优化和选育有重要意义。

高粱SPL基因家族的鉴定及表达分析

Squamosa启动子结合类蛋白(SPL)基因家族编码一类植物特有的转录因子,其功能涉及作物遗传改良的许多方面,如产量、株型、抗逆性等,具有重要的实际应用价值。虽然SPL基因在很多作物中有广泛研究,但是在高粱中仍有待进一步探索。本研究通过生物信息学方法,利用同源序列法在高粱基因组水平对SPL基因家族进行分离和分析,共获得19个高粱SPL基因,并命名为SbSPL。高粱SbSPL家族基因不均匀地分布于高粱9条染色体上。通过系统进化树、保守结构域和基因结构等分析,将SbSPL基因家族成员分为5组,不同组的SbSPL基因在功能结构上具有保守性。此外,分析了SbSPL基因家族成员的启动子,发现SbSPL基因家族具有响应非生物胁迫相关信号转导的顺式作用元件。利用qRT-PCR技术,发现部分高粱SbSPL基因的表达受干旱胁迫诱导。这些结果揭示了SbSPL基因可能在高粱响应环境非生物胁迫过程中起到重要作用。

高粱磷脂酶D基因家族的鉴定和表达分析

磷脂酶D(PLD)是植物生长和胁迫反应过程中参与膜磷脂分解代谢的关键酶。PLD编码基因在高等植物中构成了一个大的基因家族,但是仍未对高粱PLD基因家族进行深入研究。本研究中,通过全基因组分析,鉴定了15个PLD基因,并分成6个亚组,初步揭示了SbPLDs的基因结构、保守结构域、染色体定位和系统发育关系等信息。基因复制的研究表明,片段复制在高粱PLD基因家族的扩展中发挥了重要作用,SbPLDs在进化过程中经历了强烈的纯化选择。此外,转录组数据表明,受启动子区上游顺式元件调控的PLD家族基因可能在高粱的生长发育中发挥重要作用。通过real-time PCR分析,显示部分SbPLDs参与非生物胁迫和激素途径的潜力。亚细胞定位表明,高粱PLD蛋白在细胞质中富集,可能具有抗逆胁迫的功能。本研究为了解高粱PLD基因的特征提供了理论参考,为研究高粱PLD基因家族的进化提供了新的视角,也为阐明高粱PLD基因家族的功能提供了基础信息。

高粱BTx623幼胚遗传转化及再生体系的建立

高粱是世界上仅次于小麦、水稻、玉米和大麦的重要作物之一,虽然高粱基因组已经完成了测序,但是针对高粱测序品种BTx623,高效、稳定的遗传转化和再生体系的缺乏,阻碍了高粱遗传育种和功能基因组研究发展。本研究以高粱基因组测序品种BTx623幼胚为外植体材料,利用农杆菌介导的方法以抗草铵膦的Bar基因为筛选标记进行高粱遗传转化。通过筛选愈伤组织对不同浓度草铵膦的适应性,确定了高粱品种BTx623遗传转化中合适的草铵膦浓度为2.5 mg/L。以BTx623幼胚为外植体转化材料,通过农杆菌遗传转化方法,获得抗性愈伤组织。通过在分化培养中添加浓度为0.0067 mg/L的ZNC,建立了高粱品种BTx623的植株再生体系,获得了再生植株。因此,本研究成功获得了抗性愈伤组织和再生植株,建立了高粱品种BTx623遗传转化及再生体系,这对高粱功能基因组研究和遗传育种技术发展具有重要意义。