绵羊以肝片吸虫为主多种寄生虫混合感染的诊治

2019年冬季,黑龙江省某养殖户饲养的绵羊开始发病并陆续死亡,死亡率为10.2%,给养殖户造成了很大经济损失。为了对该群绵羊患病、死亡原因进行探究,制订正确的治疗方案,试验采用流行病学调查、病理剖检和实验室检验等方法对患病绵羊进行综合诊断。结果表明:该群绵羊主要感染肝片吸虫,同时伴有前后盘吸虫、莫尼茨绦虫、消化道线虫及球虫等多种寄生虫混合感染,采用特效药物治疗后,绵羊全部治愈。说明本起病例诊断准确,治疗得当。

犬体内类圆线虫的分子鉴定

为了鉴定来自斗牛犬体内的类圆线虫种类,试验提取了虫体的总DNA,对核糖体内转录间隔区（ITS）和线粒体细胞色素C氧化酶第Ⅰ亚基（cox1）部分序列进行扩增、克隆、同源性分析及构建系统进化树。结果表明：rDNA ITS序列全长为580 bp,其中ITS1序列长度为216 bp;得到的cox1序列长度为961 bp;ITS1和cox1序列均与粪类圆线虫同源性最高,分别为99.5%和99.8%;基于ITS1和cox1序列与Gen Bank中相关线虫进行遗传进化分析,类圆属线虫处在一个大的进化分支上,亲缘关系最近。说明采自病犬体内的线虫为粪类圆线虫。

片形吸虫“中间型”组织蛋白酶L2基因的原核表达及鉴定

组织蛋白酶L2(CathepsinL2,CatL2)存在于片形吸虫发育的各个时期,具有潜在的免疫保护性及诊断性。为了获得片形吸虫"中间型"("intermediate form"of Fasciola,Fsp)CatL2基因的重组蛋白,根据GenBank中公布的肝片形吸虫组织蛋白酶L2基因设计特异性引物,应用RT-PCR获得虫体的FspCatL2基因,经TA克隆后,进行测序及生物学分析;进一步构建原核表达重组质粒PET-28a(+)-FspCatL2,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行诱导表达,将纯化后的蛋白进行SDS-PAGE和Western Blot分析。结果表明扩增得到的FspCatL2基因的大小为933 bp,编码311个氨基酸,生物信息学显示FspCatL2有较多的α-螺旋,具有较好的抗原表位,推测该蛋白应有较好的抗原性。SDS-PAGE结果显示在35 kDa处有目的条带,Western Blot分析发现重组FspCatL2与片形吸虫"中间型"阳性血清发生反应,而与阴性血清不发生反应。实验成功克隆表达了片形吸虫"中间型"组织蛋白酶L2,为进一步研究其功能奠定了基础。

片形吸虫“中间型”核糖体大小亚基序列多态位点的解析

为了分析片形吸虫"中间型"核糖体rDNA大小亚基中是否存在多态位点,试验通过经典分子生物学方法对采自青海省、广西壮族自治区和黑龙江省的片形吸虫进行准确鉴定,扩增3个地区片形吸虫rDNA的18S和28S序列,通过比对序列分析可能存在的多态位点,最后对可能存在的多态位点片段进行克隆验证。结果表明:采自青海省、广西壮族自治区和黑龙江省的片形吸虫分别是肝片吸虫、大片吸虫和片形吸虫"中间型",片形吸虫"中间型"18S的第653位和28S的第371,575,1422,2981位为多态位点。说明片形吸虫"中间型"rDNA 18S和28S序列存在5个新的多态位点,丰富了片形吸虫分子分类的标记基因。

肝片吸虫天冬氨酰内肽酶的原核表达及反应原性分析

为了获得肝片吸虫天冬氨酰内肽酶(Fasciola hepatica legumain, FhLEG)基因的重组蛋白,分析其作为诊断抗原的可能性,试验根据GenBank中公布的FhLEG基因序列(登录号为AJ314846)设计特异性引物,以肝片吸虫总RNA为模板通过RT-PCR方法获得FhLEG基因,经克隆后测序并利用DNAStar 7.1、ExPASy和SWISS MODEL软件进行生物学分析。构建表达重组质粒pET-28a(+)-FhLEG,在大肠杆菌Rosetta (DE3)感受态细胞中诱导表达,对表达后的LEG蛋白进行SDS-PAGE检测,纯化后进行Western-blot分析。结果表明:扩增得到的FhLEG核苷酸序列大小为1 260 bp, A+T含量为56.9%,与GenBank中收录的肝片吸虫LEG核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为99.6%和99.3%。LEG蛋白主要由6个α-螺旋、3个β-折叠和1个β-转角构成,具有较好的抗原表位,推测该蛋白可能具有较好的抗原性。经SDS-PAGE电泳,在51 ku处检测到目的条带,重组蛋白FhLEG与肝片吸虫阳性血清发生反应,而与阴性血清不发生反应。说明肝片吸虫天冬氨酰内肽酶具有良好的反应原性。

基于移动平台的就业服务系统的设计与研究

人才就业市场为了更好地提供就业服务,搭建企业和就业者互联互通的信息桥梁,设计出一套基于移动平台的就业服务系统。该就业服务系统拟采用C/S结构,服务器端利用Java EE技术实现数据的录入、处理和访问等信息,客户端将采用HTML5和Android相结合来展现页面信息,通过JSON数据格式来实现客户端和服务器端的数据交互。

日本血吸虫m6A修饰的性别相关circRNA鉴定

目的研究日本血吸虫雌雄成虫环状RNA(circRNA)的N6⁃腺苷酸甲基化(m6A)修饰,并对circRNA可能调控的miRNA进行预测。方法取(100±2)条日本血吸虫尾蚴,经腹部皮肤感染小鼠20 min,28 d后麻醉小鼠,用肝门静脉灌洗法收集虫体,分离雌雄虫,提取雌雄虫总RNA,分别取0.5μg和1.0μg点样在尼龙膜上,转移至紫外交联仪中,依次与m6A抗体(1∶1000)和HRP标记的二抗(1∶5000)孵育,进行斑点杂交。取雌雄虫总RNA各1μg,应用RNA甲基化共沉淀试剂盒进行免疫沉淀分离,RNA建库试剂盒进行建库,生物分析仪质量检测后在高通量测序仪上采用150 bp双端模式进行测序。应用Cutadapt软件(v1.9.3)除去序列中的接头与低质量序列,获得高质量序列。使用Bowtie2软件将序列与血吸虫基因组(Sja_WBPS14)匹配,以Find_circ软件识别序列中的circRNA,MACS软件识别序列中的甲基化位点。利用Heatmap2软件对差异表达的circRNA进行聚类分析,对差异有统计学意义的m6A修饰的circRNA进行来源基因的基因本体论(GO)富集分析。利用DiffReps软件分析m6A修饰的circRNA在雌雄虫的差异情况。通过RNAhybrid软件预测与circRNA相互作用的miRNA,将miRNA反转录后进行qPCR分析,2-ΔCt法计算miRNA相对表达水平。结果斑点杂交结果显示,日本血吸虫总RNA存在m6A甲基化修饰,且随着RNA量的增多,m6A甲基化信号趋于增强。高通量测序结果显示,日本血吸虫高质量序列占比高于99.9%,RNA富集与文库构建效果良好。来源于重叠区的circRNA占49%,其次是外显子(占29%)和基因间(占12%),来源于内含子(占2%)和反义链(占8%)的circRNA较少。雄虫中高富集的circRNA来源的基因可能与细胞代谢进程、细胞成分组织生物发生和应激等相关,雌虫中高富集的circRNA来源的基因可能参与细胞分子结合等过程。雌虫高丰度的m6A修饰circRNA有57个,雄虫有81个,雄虫富集的m6A修饰的circRNA数量高于雌虫(P<0.05,差异倍数≥2)。雌雄虫中m6A修饰circRNA可潜在与多个miRNA相互作用,如Sja⁃Bantam、Sja⁃miR⁃307在雌虫中呈现高表达,Sja⁃miR⁃8⁃3p、Sja⁃miR⁃3504等在雄虫中呈现高表达。结论本研究获得了日本血吸虫雌雄成虫m6A修饰的circRNA表达谱,初步揭示了m6A修饰circRNA可能调控的miRNA。