预防兽医学细菌病综合实习的设计与实践

细菌病综合实习是提升动物医学专业预防兽医学实践教学质量的重要环节。针对传统预防兽医学中细菌学实验内容零碎、不系统的现状,本文提出融合细菌学相关实验技术,开展连续性好、综合性强的细菌病综合实习。该实习从混合细菌感染动物人工造病开始,通过一系列实验技术手段分离、纯化和鉴定细菌,进而确诊病因,实施后显著提升了学生的综合实践能力和科研创新水平,有利于新时代高素质动物医学专业人才的培养。

新型鸭呼肠孤病毒弱毒S株在雏番鸭体内的增殖规律

【目的】研究新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)弱毒S株C30在雏番鸭血液中的病毒血症,口咽、泄殖腔的排毒规律及靶器官的带毒时间,了解弱毒S株在雏番鸭体内的增殖规律和致弱机理。【方法】设计特异性引物,建立检测NDRV核酸的RT-qPCR方法;新型鸭呼肠孤病毒弱毒S株第30代(NDRV-S-C30)腿部肌肉注射2日龄雏番鸭,在免疫后1、2、3、4、6、8、10、12、14 d(Days post vaccination,dpv)采集其血液、肝脏、脾脏、泄殖腔分泌液和口咽液,用RT-qPCR方法检测NDRV在血液、口咽、泄殖腔及靶器官的增殖能力及带毒时间。【结果】建立了检测NDRV核酸的特异性RT-qPCR方法,使用该方法检测NDRV弱毒攻毒雏鸭的口咽和泄殖腔排毒时间分别为2~8 d和2~10 d,排毒高峰期为4~6 d;病毒血症时间为1~4 d,其中1~2 d为病毒血症高峰期;弱毒在肝脏的带毒时间为3~6 d,在脾脏的带毒时间为1~8 d。【结论】NDRV-S-C30弱毒株免疫雏番鸭后可通过口腔和泄殖腔向外界排毒,仅能引起较弱的病毒血症反应,且在肝脏中的增殖能力弱,丧失了对易感靶器官造成病理损伤的能力。明确了NDRV弱毒S株的排毒规律及病毒血症时间,为建立弱毒免疫效力评价方法奠定了基础。

猪伪狂犬病病毒FZ株的分离鉴定及gD基因序列分析

采集福州郊区病仔猪的鼻腔黏液、脑、脾脏、肾脏、淋巴结等组织病料,研磨上清接种到非洲绿猴肾(Vero)细胞和狗肾(MDCK)细胞进行病毒分离,通过对分离病毒株进行形态学、血清学、荧光抗体试验、动物接种试验、PCR试验等鉴定,确定所分离的病毒为猪伪狂犬病病毒(PRV),命名为PRV-FZ株.根据GenBank收录的PRV gD基因的序列设计一对引物,通过PCR方法扩增出约1579 bp的目的片段,并将其克隆到PCAGGS载体进行酶切鉴定、核苷酸序列测定和分析.结果表明,目的片段包含一个1203 bp的开放阅读框,编码400个氨基酸组成的多肽,与GenBank中有代表性的5株参考毒株相应基因序列比较显示,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.1%-99.8%和98.5%-99.5%.用Bioedit和TMPRED软件预测PRV-FZ gD基因的跨膜区,表明存在2处显著意义的跨膜区;用Predictprotein软件结构域预测,表明该蛋白存在2个cAMP-/cGMP-依赖蛋白激酶磷酸化位点、5个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点及3对二硫键.

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)抗体水平检测与分析

为探讨PRRS免疫猪场和非免疫猪场抗体水平差异,采集福建各地区64个不同规模猪场血清样本1 742份,其中免疫猪场40个共1 059份血清,非免疫猪场24个共683份血清;采用美国IDEXX公司PRRS病毒抗体ELISA试剂盒进行检测,分析其抗体阳性率、CV值及S/P区间分布值。结果显示:免疫猪场抗体阳性883份,阳性率算术平均值为83.4%,CV值为67.1,S/P值大于2.5的样本44份,占4.2%;非免疫猪场抗体阳性290份,阳性率算术平均值为42.5%,CV值为87.4,S/P值大于2.5的样本74份,占10.1%。表明免疫猪场抗体阳性率高,离散度小;非免疫猪场均可检测到PRRS阳性抗体,离散度大。揭示应加强PRRS的免疫,对疫情防控具有积极作用。

猪伪狂犬病病毒FZ株的分离鉴定

从福州郊区某猪场发生疑似伪狂犬病的仔猪中分离到一株病毒。该病毒株感染Vero细胞、MDCK细胞均可产生典型的细胞病变,并可见合胞体。感染仔猪症状较轻,但在攻毒后25d,可检测到伪狂犬病抗体,并在仔猪的肺气管冲洗液中回收到同样理化特性的病毒。接种成兔和小白鼠均可出现典型的伪狂犬病症状。电镜观察可见110～180nm大小不等、不规则圆形、有囊膜的伪狂犬病毒粒子。用MDCK细胞测定其TCID50为10-6.604/0.1mL,能被PRV标准阳性血清所中和,效价为1∶77。对乙醚、热、胰蛋白酶敏感,在pH5.0～9.0之间保持稳定。尿囊膜接种9～12日龄鸡胚,86h可见尿囊膜水肿、出血,有大小不一白色痘斑样病灶,胚体萎缩,头盖部突起、全身弥漫性出血。制作细胞飞片,8h用PRV荧光抗体染色,可观察到细胞浆内呈现散在的翠绿色荧光。PCR反应可扩增出特异性1579bpDNA片段。证实分离的病毒株为伪狂犬病病毒,并命名为PRVFZ株。

梅花鹿巴氏杆菌病的诊断与防治

2011年1月福州郊区某梅花鹿饲养场发生了一种以体温升高、呼吸困难、发病急、病死率高为特征的疾病。根据发病情况、临床症状、病理剖检及实验室检查,确诊为鹿巴氏杆菌病。经及时采取综合防治措施,有效控制了该病的流行。

一起肉鸡卡氏住白虫病的诊治

鸡卡氏住白虫病俗称白冠病.该病常呈地方性流行,有明显的季节性,多发于5月至9月份,对雏鸡和中鸡危害严重,造成大批死亡,成鸡死亡较少,但产蛋率下降.

番鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定

从番鸭肝“白点病”患鸭的肝脾匀浆中分离到 7个病毒分离株 .在电镜下观察到病毒粒子呈球形 ,无囊膜 ,有可见的双层衣壳结构 ,外壳直径 75nm,内核直径 50 nm;病毒核酸型为 RNA;不凝集鸡、鸭、兔、豚鼠红细胞 ,与禽呼肠孤病毒有一定的抗原相关性 ;对番鸭胚和鸡胚成纤维细胞可致感染细胞圆缩、融合 ,出现多核细胞和巨细胞 ,胞浆内有近核包涵体 ;试验感染 1日龄敏感雏番鸭死亡率达 10 0 % ,临床及病理变化与自然感染发病的番鸭基本一致 ,并可回收到该病毒 .结果表明 ,目前国内流行的番鸭肝“白点病”

鱼腥草抗病毒合剂对鸡法氏囊病的疗效及小鼠的免疫作用

鱼腥草菌毒克星合剂是按照中医学理论研制的一种抗动物病毒性疾病的中草药调节剂,对人工攻毒引起的禽法氏囊炎有很好的治疗作用.免疫试验也证明,其能增强小白鼠的巨噬细胞吞噬功能,促进小白鼠脾淋巴细胞玫瑰花结形成,并能诱生干扰素,由此验证了本制剂对动物的免疫作用.

福建不同生态类型鸭种(群)的遗传多样性研究

用 4 0个 10碱基随机引物对福建 2个生态类型的 7个地方鸭种的基因组池DNA进行了RAPD分析 ,从扩增产物表现为多态的引物筛选出 9个特异性强的引物进行个体DNA的RAPD分析 ,并利用Shannon指数估算了 2个生态区域鸭群的遗传多样性 ,探讨了它们与生态环境之间的关系及其变化规律 .结果表明 ,福建境内的地方鸭种具有较高的遗传多样性 ,闽东沿海地区鸭群有 6 7.97%的遗传变异来自群体内 ,32 .0 3%来自于群体间 ;闽西山地丘陵地区鸭群有 5 9.0 5 %的遗传变异来自群体内 ,4 0 .95 %来自于群体间 ;闽东地区鸭群的遗传变异明显高于闽西地区鸭群 .同时 ,用非加权组平均法 (UPGMA)对各种群的聚类分析表明 ,闽西地区的连城白鸭、泰宁麻鸭、龙岩山麻鸭和三明麻鸭归为一类 ;闽东地区的龙海金定鸭和莆田黑鸭聚为一类 .不同生态区域内鸭群的遗传变异与地理位置存在一定的相关性 .

羊口疮病毒感染OFTu细胞的超微结构电镜观察

通过透射电子显微技术对羊口疮病毒(ORFV)YX强毒株感染羊胚胎鼻甲细胞(OFTu)的细胞超微结构和病毒形态发生学进行研究.结果显示,成熟的病毒粒子呈椭圆形,有囊膜,大小约为150 nm×250 nm,可见两面凹陷呈哑铃形的核酸芯髓和2个侧小体结构.病毒在胞浆中复制,在高尔基体形成囊膜,最后病毒粒子通过细胞膜出芽和细胞裂解方式释放病毒粒子.感染细胞超微结构主要表现为:内质网扩张呈囊、池内分离;线粒体增生、嵴肿胀、变暗、模糊不清,最后空泡化;高尔基体出芽、扩张;细胞核溶解呈早期凋亡现象,胞浆出芽,最后整个细胞裂解、破碎.

鹌鹑新城疫病毒的分离与鉴定

从表现呼吸道症状、拉黄绿色稀粪为主要特征的发病鹌鹑的脑、脾、肺气管粘液中分离到一株病毒,经HA、HI试验、血清中和试验及动物回归试验,证实所分离毒株为新城疫病毒。

鸭疫里默氏菌的分离鉴定

采集福州郊区某番鸭场病死鸭的肝、脾、脑、心血,从中分离到1株细菌,经对分离菌进行培养特性、形态观察、生化鉴定及荧光抗体试验,确定为鸭疫里默氏菌。经人工感染试验,表明该菌对雏鸭有较强的致病力,致死率高达47%。

猪伪狂犬病病毒NP株的分离鉴定

2013年下半年,福建某免疫接种过猪伪狂犬病疫苗(Bartha)的规模化猪场大批妊娠母猪发生流产、新生仔猪发生共济失调的神经症状,疑似为猪伪狂犬病病毒感染发病症状,为确定发病原因,从该猪场疑似伪狂犬病病毒感染的仔猪脑、肝脏和肺脏中分离到一株未知病毒,PCR检测及测序比对鉴定为猪伪狂犬病病毒,并将分离的病毒命名为NP株。用Reed-Muench法测定分离株病毒的组织细胞半数感染量(TCID50)为10-9.13/0.1mL,动物攻毒试验出现猪伪狂犬病病毒感染的典型症状。试验结果表明,成功分离到一株猪伪狂犬病病毒毒株,为研究福建省猪群伪狂犬病病毒分子流行病学奠定基础。

猪伪狂犬病病毒NP株gE、gI基因的克隆及序列分析

根据GenBank中已发表的猪伪狂犬病病毒（PRV）gE、gI基因的序列设计了2对引物,对PRV NP株的gE、gI基因进行了PCR扩增、回收、克隆、测序,测序结果与预期的PRVgE、gI基因片段相符。同源性比对分析结果显示,PRV NP株gE、gI基因推导的氨基酸序列与国内分离的PRV毒株的同源性分别为95.7%~99.8%、89.9%~99.5%。遗传进化树分析和氨基酸序列比对结果发现PRV NP株的gE氨基酸序列发生变化的位点与2012年国内分离到的PRV流行株相同,从而推测NP株为PRV变异毒株,本研究为PRV的流行病学调查分析奠定了基础,也为开发科学、有效的新型猪伪狂犬病（PR）疫苗提供科学依据。

福建地区猪圆环病毒2型全基因序列遗传演化分析及病理学观察

为了解福建地区猪圆环病毒2型(PCV2)感染病变及分子遗传演化情况,采集来自不同猪场29份临床疑似感染PCV2的组织病料,进行了病理学观察、PCR检测、全基因测序及分析。结果表明,淋巴小结及淋巴细胞数量减少,肺泡腔内炎性细胞浸润;29份病料检出20份PCV2阳性,阳性率为68.9%;获得20株完整PCV2全基因序列,同源性为96.0%~99.9%;进化树分析,1株为PCV2a(占5%),11株为PCV2b(占55%),8株为PCV2d(占40%);ORF2变异性分析,发现PCV2b和PCV2d分别存在1个和3个区别于其他基因型的独特氨基酸位点,PCV2b为210(E),PCV2d为53(I)、68(N)和133-134(AN)。研究结果充实了PCV2分子流行病学数据,为疫苗选择及基因型鉴别提供参考。

灵芝和菌糠降低鸡蛋胆固醇的试验研究

选取48周龄海兰褐商品蛋鸡120羽,随机分成3组,试验期为4周,对照组Ⅰ组喂基础日粮,试验Ⅱ组添加2.5g/kg灵芝,试验Ⅲ组添加2.5g/kg菌糠,在一致的背景下,探讨灵芝、菌糠对鸡蛋胆固醇的影响。结果表明:Ⅱ、Ⅲ组可降低蛋鸡血液甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)含量,增高血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量;3组之间料蛋比差异显著,Ⅱ、Ⅲ组料蛋比分别比对照组低6.4%(P<0.05)、11.0%(P<0.05)。Ⅱ、Ⅲ组平均产蛋率分别比对照组提高5.38%(P<0.05)和3.29%(P<0.05)。试验4周,Ⅱ、Ⅲ组鸡蛋胆固醇含量分别降低15.3%(P<0.05)和10.4%(P<0.05),且两组间差异显著(P<0.05),研究表明灵芝及菌糠均能提高蛋鸡生产性能,降低鸡蛋胆固醇含量。相比之下,灵芝是降低鸡蛋胆固醇较为理想的添加剂。

羊口疮病毒ORF080基因的原核表达、纯化及鉴定

本试验旨在原核表达、纯化羊口疮病毒ORF080蛋白并鉴定其反应性.根据GenBank已发表的羊口疮病毒OV-GO株ORF080基因序列(登录号:KP010354),将密码子优化后合成该序列并克隆至pET-32a(+)原核表达载体中,构建pET-32a(+)-ORF080重组质粒.经双酶切和测序鉴定后转化至大肠杆菌Rossetta感受态细胞中,用IPTG诱导,诱导产物经SDS-PAGE鉴定,重组蛋白以可溶性和包涵体两种形式获得表达.采用镍柱对可溶性重组蛋白进行纯化,再经SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹双重鉴定.SDS-PAGE检测结果显示,在57 ku处出现单一重组蛋白条带;蛋白质免疫印迹鉴定证实该纯化的蛋白能与抗组氨酸标签的抗体和羊口疮阳性血清发生特异性反应,证明成功表达并纯化出具有良好反应性的ORF080蛋白.试验结果为进一步对ORF080蛋白结构、功能及基因工程疫苗的研究提供参考.

山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组序列分析及其gag基因促肿瘤发生的机制研究

本研究旨在获得山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus 2,ENTV-2)全基因组序列并进行分析。从福建某羊场的山羊鼻内肿瘤组织取样,针对ENTV-2设计引物,通过RT-PCR方法从肿瘤组织中分段扩增出6个特异性产物,测序后利用生物学软件DNAStar进行拼接,获得长度为7443 bp全基因组序列,将其命名为ENTV-2-FJ。ENTV-2-FJ基因组结构与其他逆转录病毒类似,具有5′-U5-gag-pro-pol-env-U3-3′典型结构,包含4个开放阅读框和侧翼非编码区以及末端重复序列。为制备兔抗ENTV-2 gag蛋白多克隆抗体,将特异性扩增的gag基因克隆至pET-21a(+)载体,构建重组质粒pET-21a-gag,鉴定后转化至BL21(DE3)细胞并经IPTG诱导成功表达分子量约为70 ku的融合蛋白。Western blot分析表明,制备的兔抗gag蛋白抗体能在患病山羊肿瘤组织和表达gag基因的细胞中特异性地检测出gag蛋白。为了深入研究ENTV-2-FJ致瘤机制,作者构建了过表达gag基因的K562细胞系,并进行裸鼠致瘤试验。结果显示,gag蛋白通过激活JAK2-STAT5信号通路促进肿瘤的生长。综上,本研究获得了ENTV-2-FJ全基因组序列并对其进行分析,制备并验证了gag蛋白的多克隆抗体,揭示了gag蛋白的作用机制,这些结果为阐明ENTV-2的致病机制提供了科学依据。