ppk1基因对尿路致病性大肠埃希菌药物敏感性的影响及其机制

目的探讨多聚磷酸盐激酶1(ppk1)基因缺失对尿路致病性大肠埃希菌药物敏感性的影响及其机制。方法在本团队以往的研究中以尿路致病性大肠埃希菌CFT073为标准野生菌株,并成功构建敲除株△pk1和回补株△pk1-C。分别使用纸片扩散法和微量肉汤法检测CFT073、△pk1和△pk1-C对抗菌药物的敏感性;实时荧光定量PCR法对CFT073和△pk1的耐药性相关基因进行定量分析,对使用β-内酰胺类药物刺激的CFT073和△pk1的耐药性相关基因进行定量分析。结果与CFT073相比,两种药敏实验结果均显示△pk1对头孢噻肟、哌拉西林、他唑巴坦、氯霉素、呋喃妥因、磺胺甲噁唑和多黏菌素B的敏感性增强(P<0.05),而△pk1-C的敏感性无差异;实时荧光定量PCR检测CFT073和△pk1耐药性相关基因结果显示,ompF在△pk1中的表达明显上调,ompC、ompA、mdtA、mdtG、marB、marC和pmrD在△pk1中的表达相对下调,ompW和tolC在两菌株中的表达无差异;分别经哌拉西林和头孢噻肟刺激后,CFT073株ompA、ompW和tolC基因的表达量均升高,△pk1的均无统计学差异。结论ppk1基因的缺失使尿路致病性大肠埃希菌对某些抗菌药物的耐药性降低,并且ppk1基因可以影响其耐药性相关基因的表达。

多聚磷酸盐激酶的原核表达、纯化及酶活性测定

目的原核表达、纯化多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinase,PPK),并检测其酶活性。方法采用PCR法从尿路致病性E.coli CFT073中扩增ppk基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-ppk,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。重组蛋白经His-镍亲和层析柱分离纯化后,采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色法测定纯化蛋白的酶活性。结果重组表达质粒pET-28a-ppk经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。重组蛋白的相对分子质量约80000,纯化后蛋白浓度为518.9μg/mL。在加入10μg PPK酶,37℃孵育30 min的条件下测得的PPK酶活性最大,为(645.16±32.98)U/mg。结论成功在E.coli中表达了重组PPK,纯化产物纯度较高,具有PPK酶活性,为后续以PPK为靶点新型抗菌药物的研发奠定了基础。

尿液S100A6蛋白与细菌/真菌性尿路感染的相关性

目的探讨尿液S100A6蛋白与细菌/真菌性尿路感染(urinary tract infection,UTI)的相关性。方法临床收集正常组和感染组尿液样本各110份,其中感染组患者具有典型的UTI症状,尿常规检测及尿液培养(细菌/真菌培养)结果均为阳性;正常对照组样本的尿液生化检查及尿液培养结果均为阴性。ELISA法检测尿液样本的A450值,Curve Expert软件计算S100A6蛋白的含量,应用SPSS 16.0软件进行Logistic回归分析,绘制ROC曲线,评价S100A6蛋白在尿路感染中的诊断价值。将感染组尿液样本于室温放置2、4、8、10、12、24、48、96 h,Western blot法检测尿液样本中S100A6蛋白含量的稳定性。结果感染组尿液样本中S100A6蛋白含量明显高于正常组(P <0.01)。Logistic回归方程为y=-0.971+0.04 x,OR值为1.004,P=0.001;ROC曲线下面积=0.862,约登指数=0.628,S100A6取临界值=23.277 pg/mL时,灵敏度为91.2%,特异度为71.6%。感染组尿液样本于室温放置2、4、8、10、12、24、48、96 h后,S100A6蛋白含量变化差异无统计学意义(P> 0.05)。结论 S100A6蛋白与UTI的相关性较大,具有潜在的UTI诊断价值,有望成为UTI初筛的新指标。