RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α对胃癌细胞生物学行为的影响

目的:观察RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对胃癌细胞增殖﹑凋亡﹑侵袭性的影响并探讨其可能的分子机制。方法:将HIF-1α短发夹RNA(shRNA)重组质粒pGCsi-shHIF-1α稳定转染人胃癌细胞SGC-7901;采用RT-PCR和Western blot法检测HIF-1α mRNA、蛋白表达水平,Western blot法检测葡萄糖转运蛋白1(Glut-1)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)及趋化因子受体CXCR4蛋白表达;MTT法、流式细胞仪、transwell试验分别检测转染细胞的增殖、凋亡及侵袭迁移能力。结果:稳定转染pGCsi-shHIF-1α后,SGC-7901细胞HIF-1α表达在mRNA及蛋白水平均受到明显抑制,Glut-1﹑MMP-2﹑CXCR4蛋白表达较对照组降低;细胞增殖能力较对照组明显降低,细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05);细胞体外侵袭迁移能力受到明显抑制(P<0.01)。结论:pGCsi-shHIF-1α能有效沉默胃癌细胞SGC-7901 HIF-1α基因表达,抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭并诱导其凋亡,提示HIF-1α可能通过上调Glut-1﹑MMP-2和CXCR4等从而调节肿瘤细胞生长及转移。

血管生成拟态与肿瘤微循环

血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)是近几年在少数高度恶性肿瘤中发现的一种独立于血管生成的全新肿瘤内微循环模式,即由恶性肿瘤细胞而非血管内皮细胞围成、细胞外基质界限的血管样结构.VM与肿瘤侵袭、转移及患者预后密切相关,其发生和肿瘤细胞呈现多潜能胚胎样表型及多种蛋白分子的生物学效应有关,肿瘤局部微环境也起着重要作用.现就VM的特点、发生机制及临床意义等研究进展作一综述.

RNA干扰HIF-1α对食管癌细胞糖酵解相关基因表达的影响

目的:探讨常氧及缺氧培养对RNA干扰的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)及糖酵解相关基因表达的影响。方法:选择3组细胞分别为食管鳞癌Eca-109细胞稳定转染HIF-1α siRNA及空质粒的Eca-109细胞,予以常氧和缺氧培养,缺氧培养时间分别为6、12、24、48h,采用Western blot检测HIF-1α蛋白表达,Western blot和RT-PCR检测3组细胞常氧和缺氧条件下糖酵解相关基因(Glut-1、LDH-A、HK-Ⅱ)的表达,分光光度法分别测定3组细胞常氧和缺氧培养下胞液中乳酸脱氢酶(LDH)、己糖激酶(HK)酶活性。结果:Eca-109细胞缺氧条件下培养,HIF-1α蛋白表达较常氧时增高,干扰细胞常氧下HIF-1α几乎无表达,缺氧后亦无增强。常氧和缺氧条件下,干扰细胞Glut-1、LDH-A、HK-Ⅱ mRNA和蛋白表达较未干扰细胞明显减弱(P<0.05),干扰细胞胞液LDH、HK活性较未干扰细胞明显减少(P<0.05)。结论:RNA干扰能抑制Eca-109细胞的HIF-1α基因表达,进而不同程度减少Glut-1、LDH-A、HK-Ⅱ糖酵解相关基因的表达。

HIF-1α沉默对食管鳞癌血管生成拟态相关基因影响的体内研究

目的:探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因沉默对人食管鳞癌细胞体内血管生成拟态相关基因表达的影响。方法:将食管鳞癌Eca109细胞株分为空白对照组(未转染组)、阴性对照组(转染空质粒组)和实验组(稳定转染重组质粒pGCsi-shHIF-1α组),接种裸鼠,观测裸鼠皮下移植瘤生长情况;HE染色观察各组肿瘤的异型性及坏死情况;免疫组化和Western blot法检测HIF-1α与上皮细胞激酶(EPHA2)、血管上皮钙黏附素(VE-cadherin)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)在肿瘤组织中的蛋白表达;RT-PCR检测移植瘤组织中HIF-1α与EPHA2、VE-cadherin、MMP-2的mRNA表达。结果:实验组出瘤时间延迟,生长速度减慢,移植瘤体积及重量明显减少(P<0.05);HE染色示肿瘤异型性减少,坏死显著增多;免疫组化及Western blot发现实验组HIF-1α蛋白表达完全沉默,EPHA2、VE-cadherin表达明显减少(P<0.05);RT-PCR提示实验组中HIF-1α及EPHA2、VE-cadherin、MMP2的mRNA含量均有不同程度减少,其中EPHA2、VE-cadherin减少明显(P<0.05)。结论:HIF-1α沉默能显著抑制食管鳞癌裸鼠移植瘤的生长,并能有效抑制移植瘤血管生成拟态相关基因EPHA2和VE-cadherin的表达,HIF-1α有可能通过以上2个位点参与食管鳞癌血管生成拟态的调控。

RNA干扰HIF-1α对食管鳞癌血管生成拟态的影响

背景:研究表明大量高度恶性肿瘤组织中存在血管生成拟态(VM),其分子机制已形成相关假说,但确切机制和关键信号通路尚未明确。目的:探讨缺氧诱导因子(HIF)-1α在食管鳞癌VM形成中的作用。方法:设计合成3种HIF-1α-siRNA质粒,测序后瞬时转染293T细胞,蛋白质印迹法鉴定质粒的干扰效果。将筛选出的pGCsi-HIF3质粒稳定转染食管鳞癌细胞株Eca109和TE13,以蛋白质印迹法检测干扰效果,三维培养法观察VM形成情况,蛋白质印迹法检测VE-cadherin、EphA2、LN5γ2和MMP2蛋白表达。结果:成功构建了3个靶位的质粒,其中pGCsiHIF3的干扰效果最好。pGCsi-HIF3稳定转染食管鳞癌细胞株Eca109和TE13后,与对照组相比,HIF-1α表达明显降低,细胞体外管道形成能力被明显抑制(P<0.05)。常氧下转染组细胞中VE-cadherin、EphA2、LN5γ2均显著下调(P<0.05),MMP2表达无明显差异,且缺氧条件下上述指标蛋白表达无明显增加。结论:Eca109和TE13细胞能形成管状结构,HIF-1α可能通过调节VE-cadherin、EphA2、LN5γ2等的表达而调节食管鳞癌VM的形成。

HIF-1α、EphA2表达对食管鳞癌细胞体外三维培养的影响

目的:探讨肿瘤细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、上皮细胞激酶(EphA2)对食管鳞癌血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)的影响及两者之间的关系。方法:HIF-1α、EphA2干扰质粒分别转染食管癌Eca109细胞和TE13细胞;RT-PCR、Western blot分别检测转染细胞中HIF-1α、EphA2的抑制效率;体外三维培养模拟血管生成拟态模型观察HIF-1α、EphA2抑制后细胞管状结构数量变化。结果:HIF-1α表达抑制伴随有EphA2表达下调,而EphA2表达抑制对HIF-1α表达无明显影响。HIF-1α、EphA2 miRNA干扰质粒能有效抑制Eca109和TE13中HIF-1α、EphA2的mRNA表达,无论HIF-1α或EphA2表达抑制,均能导致三维培养中管状结构数量下降。但HIF-1α抑制对管状结构的影响要强于EphA2。结论:HIF-1α、EphA2与食管癌血管生成拟态密切相关。EphA2表达调控可能是HIF-1α参与肿瘤细胞VM的形成机制之一,此外还可能存在其他调控途径。

EphA2在缺氧条件下的表达及其对食管癌细胞体外三维培养的影响

目的:探讨在正常氧分压和缺氧条件下,食管癌细胞中上皮细胞激酶A2(EphA2)表达变化及其对体外三维培养的影响.方法:正常氧分压及缺氧条件下培养食管癌Eca109及TE13细胞,RT-PCR及Western blot分别监测细胞中EphA2表达的变化;EphA2m i R NA干扰质粒转染E c a109和T E13细胞后,采用Matrigel体外三维培养观察正常氧分压和缺氧条件下,Eca109及TE13细胞在抑制EphA2表达前后管腔形成数量的变化.结果:缺氧条件下Eca109和TE13细胞中EphA2表达明显增加(P<0.05).Matrigel体外培养中,缺氧条件下其管腔形成数量明显高于正常氧分压下(P<0.05).miRNA有效抑制EphA2表达后,在正常氧分压和缺氧条件下,管腔数量明显下降,但常氧条件下数量减少更为明显(P<0.01).结论:缺氧环境能诱导肿瘤细胞EphA2高表达,并导致体外三维培养模型中管腔数量增加,抑制EphA2表达能够阻断此现象的发生,提示EphA2在缺氧条件下血管生成拟态形成过程中发挥重要作用.

RNA干扰缺氧诱导因子1α对食管鳞癌和胃腺癌细胞生物学行为的影响

目的探讨缺氧诱导因子1α（HIF－1α）对人食管癌及胃癌细胞体外增殖、迁移及血管生成拟态的影响。方法将HIF－lα－shRNA重组质粒pGCsi－shHIF－1α稳定转染人食管鳞癌细胞Eca－109和胃腺癌细胞SGC－7901，采用Western blot方法检测常氧及缺氧情况下各组转染细胞HIF－1α的抑制效果，采川平板克隆形成实验和四甲基偶氮唑蓝（MTr）法检测转染细胞的增殖活性，采用Transwell小室检测转染细胞的迁移能力，采用三维培养方法观察Eca－109和SGC－7901细胞能否形成血管网状结构及转染细胞株的管腔形成能力。结果常氧及缺氧情况下，各转染组细胞HIF－lα蛋白表达最均为0，与未转染组（Eca－109组分别为0．74±0．05和1．11±0．06，SGC-7901组分别为0．60±0．05和0．96±0．07）比较，表达均被显著抑制（均P〈0．01）。与空载体组和未转染组相比，转染组细胞的增殖活性显著降低（均P〈0．05），体外迁移能力显著降低（均P〈0．01）。Eca－109细胞株各组中，常氧情况下，Eca－109组和Eca－109／shRNA组形成管状结构数目分别为（30．8±3．9）个和（3．7±2．8）个，差异有统计学意义（P〈0．01）；缺氧情况下，分别为（34．3±3．4）个和（3．9±2．7）个，差异有统计学意义（P〈0．01）。缺氧情况下，Eca－109组形成管状结构数目较常氧时明显增加（P〈0．05）。SGC-7901细胞株各组中，常氧情况下，SGC-7901组和SGC-7901／shRNA组形成管状结构数目分别为（26．2±3．4）个和（4．9±3．5）个，差异有统计学意义（P〈0．01）；缺氧情况下，分别为（30．1±4．1）个和（5．3±3．6）个，差异有统计学意义（P〈0．01）。缺氧情况下，SGC-7901组形成管状结构数目较常氧时明显增加（P〈0．05）。结论Eca－109细胞和SGC-7901细胞均能形成血管生成拟态管状结构。RNA下扰沉默HIF－1能有效抑制Eca－109细胞和SGC-7901细胞增殖、迁移及体外血管生成拟态管状结构形成。

缺氧诱导因子-1α与EphA2在食管鳞状细胞癌中的表达及其相关性研究

目的检测缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）蛋白与EphA2蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达定位并探讨二者表达的相关性。方法采用细胞免疫荧光法检测HIF1a与EphA2在食管鳞状细胞癌细胞株Eca109中的表达与定位；采用免疫组化法检测HIF-1α与EphA2在41例食管鳞状细胞癌和25例正常食管组织中的表达；常氧和缺氧条件下，Western印迹法检测食管鳞状细胞癌细胞株Eca109和TE13经RNA干扰（RNAi）技术特异性沉默HIF-10后EphA2表达的变化。结果①细胞免疫荧光结果显示HIF-1α和EphA2均在Eca109细胞胞质表达。②免疫组化结果显示HIF-la在食管鳞状细胞癌和正常食管组织中的阳性表达率分别为70．73％（29／41）和0％（0／25），两者比较差异有统计学意义（P〈O．05）。EphA2在食管鳞状细胞癌和正常食管组织中的阳性表达率分别为78．04％（32／41）和28％（7／25），两者比较差异有统计学意义（P％0．05）。相关性检验提示HIF-1d和EphA2在食管鳞状细胞癌中表达呈正相关性（r-0．5654，x2=13．11，P〈0．05）。③Western印迹结果显示在食管鳞状细胞癌细胞株Ecal09和TEl3中，EphA2表达随HIF-1α的沉默而受抑制。结论HIF-1α与EphA2在食管鳞状细胞癌组织中呈高表达，且二者表达呈正相关；EphA2表达受HIF-1α的调控，可能为HIF-1α的靶基因。