猪链球菌基因芯片检测方法的研究

目的建立猪链球菌基因芯片检测方法,实现对猪链球菌种、致病血清型及毒力相关基因的同步检测和鉴定。方法根据GenBank中猪链球菌的相关序列,设计并合成探针,采用点样法制备芯片;检测样本基因组DNA标记后与基因芯片杂交,激光扫描检测信号。结果检测结果显示,针对猪链球菌种、主要致病血清型及主要毒力相关基因设计的寡核苷酸探针可特异地识别对应靶基因,重复性好;而针对不同菌株设计的株特异性探针未获得预期检测效果。结论初步建立猪链球菌基因芯片检测体系,敏感性与特异性高,对于高通量鉴定猪链球菌菌种及其毒力有重要价值。

13种虫媒病毒基因芯片检测方法的建立

目的建立能对虫媒病毒进行属水平筛查及种水平鉴定的基因芯片技术,为虫媒病毒提供一种高通量的检测与鉴定技术。方法从GenBank获得13种虫媒病毒的全部基因组序列,利用Clustal X和BLAST等比对软件,设计针对这些虫媒病毒所在的3个属的通用寡核苷酸探针,用于病毒的属水平筛查。然后设计针对每种病毒的特异性寡核苷酸探针,用于每种病毒的检测鉴定。寡核苷酸探针长度均为70mer,将设计好的探针与GenBank上所有病毒基因组序列进行比对,验证其种属特异性,然后进行探针合成和基因芯片制备。所有病毒在BSL-3和BSL-2实验室进行培养,待检病毒核酸通过锚定随机PCR进行扩增,经荧光染料标记后与基因芯片杂交,利用激光共聚焦扫描仪扫描后进行结果分析。结果所检测的13种虫媒病毒均可获得种特异性及所在属的属特异性杂交信号,非特异性杂交信号不明显。分别用两种不同的病毒混合后,进行模拟混合病毒感染,也得到了相应的特异杂交信号。结论初步建立了13种虫媒病毒的基因芯片检测技术,可用于这些病毒的属水平筛查及种水平鉴定,并且可以进行混合感染标本的检测,为虫媒病毒的检测与鉴定提供了一种新的手段。

人类致病病毒属水平基因筛查芯片的制备及其在黄病毒属检测中的初步应用

目的：制备人类致病病毒属水平高通量筛查用基因芯片，并通过检测黄病毒属病毒初步验证其筛查效果。方法：利用Clustal W和BLAST软件设计针对人类致病病毒的属特异性寡核苷酸探针，对探针浓度、杂交温度、杂交时间、不同杂交液及杂交后芯片的洗涤方法进行优化。分别用特异或随机PCR方法从病毒感染的细胞培养上清中扩增病毒核酸，在扩增过程中掺入aa-dUTP并进一步偶联cy5或cy3荧光素进行标记，随后与基因芯片进行杂交，并通过荧光扫描仪对杂交结果进行分析，然后分析检测的特异性和敏感性验证基因芯片的筛查效果。结果：共设计了针对人类医学病毒的1090条寡核苷酸探针及其他阳性、阴性对照探针，其中黄病毒属共46条探针，Tm值为77，67～83．53℃，通过随机或特异PCR扩增8株黄病毒属病毒核酸，在42℃、过夜杂交的条件下，通过基因芯片方法均获得了黄病毒属特异性杂交信号，与其他属病毒之间没有非特异性交叉反应。结论：所制备的基因芯片可用于黄病毒属病毒的快速筛查，本研究为进一步建立大规模病毒性病原体的高通量筛查与鉴定技术平台提供了实验依据。