一株海洋红法夫酵母Phaffia rhodozyma RP-306产虾青素的发酵条件优化

为提高海洋红法夫酵母Phaffia rhodozyma RP-306的虾青素产量,本研究利用单因素和响应面实验对其发酵条件进行了优化。首先用单因素实验确定了蔗糖、酵母粉、硫酸铵、pH、温度和装液量6个因素的初始值,再利用Plackett-Burman实验筛选出了影响较大的3个因素:蔗糖、pH、温度,并采用最陡爬坡实验确定了因素的合理范围,最后采用响应面法中的中心组合设计进行优化,其优化发酵条件为:蔗糖29.93 g/L,酵母粉2.0 g/L,硫酸铵5.0 g/L,pH 5.27,温度19.9℃。在此条件下虾青素产量从13.46 mg/L提高到17.04 mg/L,比优化前提高了26.61%。以优化后发酵条件进行分批发酵,虾青素产量达到28.86 mg/L,为进一步发酵放大研究奠定了良好基础。

一株具抗肿瘤活性的北极细菌的筛选及分子鉴定

在中国首次北极科学考察期间 ,从北极海域采集了水体 ,沉积物等样品 ,从中分离得到一批嗜冷细菌 ,采用MTT法对这些北极海洋细菌进行了细胞毒活性物质的筛选 ,得到一株具有细胞毒活性的菌株 .采用

深海细菌的分子鉴定分类

从东太平洋海底 5,30 0m深的沉积物中分离到一批嗜冷细菌 ,克隆了其中 1 3株细菌的1 6SrRNA基因 ,通过其序列的测定和比较 ,对这 1 3株细菌进行了分子鉴定 ,结果表明它们分属于副球菌 ,假单胞菌 ,盐单胞菌和假交替单胞菌 4个不同的菌属 ,同时进行了系统发育分析。

南极产低温几丁质酶菌株的筛选及分子鉴定

从南极普里兹湾深海底泥样品中分离得到一批嗜冷细菌,对这些嗜冷细菌进行了产几丁质酶菌株的筛选,对其中一株具有较高产酶活性的菌株AC167所分泌的几丁质酶进行了性质分析,并通过16S rDNA序列分析进行了菌株的分子鉴定。该菌株最适生长温度为10℃,最高生长温度为25℃,是典型的嗜冷菌,经16S rDNA序列比较及系统发育分析鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)。该菌株只在低于25℃的条件下分泌几丁质酶,酶的最适反应温度为30°C,属于低温酶。

重组鲈鱼生长激素的分离纯化及抗体制备

用IPTG诱导鲈鱼生长激素基因工程菌E coli RV30 8,使重组鲈鱼生长激素得以表达并分泌到周质空间。利用渗透休克法从菌液中提取间质蛋白 ,经DEAE SepharoseCL 6B、聚丙烯酰胺凝胶电泳及SephadexG 75纯化后得到单一电泳纯的重组鲈鱼生长激素 ,并将此激素作为抗原制备抗体 ,可应用于鱼类血液中生长激素含量的测定。

南极产低温蛋白酶菌株Marinobacter sp.R2的发酵条件及酶学性质研究

从南极海域沉积物中筛选到一产蛋白酶的菌株R2,经细菌学形态特征鉴定及16SrDNA序列分析鉴定,该菌株属于海杆菌属(Marinobacter).生长特性研究表明该菌株属于兼性嗜冷菌,其最适生长温度为10～15℃.R2菌株能利用多种碳源产酶,最适产酶温度为20℃.粗酶液经硫酸铵盐析、DEAEcellulose 52柱层析进行初步分离纯化后进行酶学性质的研究.该菌株所分泌蛋白酶的最适作用温度为20℃,最适pH值为9～10,对热敏感,是典型的低温碱性蛋白酶.Ca2+、Mn2+、Cu2+对该蛋白酶有较为明显的激活作用,而Cd2+、Co2+则能抑制酶活.高浓度的变性剂、PMSF、AEBSF和EDTA都能抑制该蛋白酶,表明该酶属于丝氨酸蛋白酶,且金属离子对酶活性中心构象有关键性的影响.

深海沉积物中微量DNA的提取及应用

采用化学裂解和酶解相结合的方法 ,进行了深海沉积物中微量DNA的提取 ,并采用DNA吸附树脂进行纯化。结果表明 ,该方法能有效地去除沉积物中的腐殖酸等抑制剂 ,每克湿重沉积物样品可得到DNA约 1 6 μg,回收率可达 95 % ,所得到的DNA分子片段均在 2 3kb左右 ,纯化后的DNA可直接应用于各种分子生物学操作。利用细菌 1 6SrDNA通用引物对所提取的深海沉积物DNA进行了PCR RFLP及系统发育分析 ,各主要细菌类群均能检出 ,证实该方法可以应用于深海等极端环境中微生物的多样性调查、系统发育分析以及特殊功能基因的筛选 。

马脾铁蛋白释放铁的反应级数和速率相数的转换

采用差示法研究铁蛋白释放铁的动力学规律和反应级数的转换。结果表明：马脾铁蛋白释放铁的速率及相数与还原剂Na2S2O4。浓度及铁还原速率无关，与该蛋白蛋白壳的调节速率有关。在pH50～6．0范围内，马脾铁蛋白以三相不同速率方式释放占原铁核总铁量80％的铁。但在pH9．0介质中，OH-不仅能参与铁蛋白铁核组成，减缓释放铁的速率，而且使原混合级反应转换为一级反应，从而使铁蛋白释放铁的动力学过程由复杂转化为简单。

羽毛角蛋白提取工艺及应用研究现状

羽毛中角蛋白资源丰富,被认为是良好的蛋白来源。但由于角蛋白独特的三维立体网状结构,使得从羽毛中获得可溶性蛋白质成为难点。综合了近年来对羽毛角蛋白降解的研究,从物理法、化学法和生物法3个方面介绍了羽毛角蛋白的提取工艺,并对目前羽毛角蛋白资源在动物饲料、纺织、皮革、环境保护等领域中的研究和应用现状进行了综述。在此基础上提出了未来羽毛角蛋白资源综合利用的发展方向。

我国近海中度嗜盐菌的分离筛选及其产酶多样性分析

为了解我国近海中度嗜盐菌系统发育多样性及产酶特性，从天津、山东、江苏、福建、海南等地近海采集样品为研究对象，分离筛选得到108株中度嗜盐菌，其中有26株至少产一种酶。通过对其形态特征、生理生化、16S rRNA 基因序列及系统进化树进行分析，将26株菌鉴定为细菌域的Halomonas、Idiomarina、Virgibacillus、Pontibacillus、Oceanobacillus、Halobacillus和 Marinilactibacillus属的菌株。它们与相应属的模式菌株16S rRNA基因序列相似性在97％～100％不等，其中有些菌株可能代表不同的分类单元。底物特异性试验表明，分离的26株中度嗜盐菌13株产蛋白酶，19株产淀粉酶，13株产酯酶，4株产纤维素酶。其中6株产3种酶，11株产2种酶。研究结果表明中度嗜盐菌具有系统发育和产酶多样性，同时蕴藏着较多新的微生物类群，为嗜盐微生物资源应用开发提供了参考。

南极阿德雷岛地表沉积物中细菌多样性及对环境的响应

提取南极阿德雷岛沉积物柱状样各层次的总DNA,利用PCR-RFLP方法,对沉积物中的细菌多样性及分布进行了研究,并探讨了它与环境的关系.结果表明,沉积物中的细菌多样性丰富,分属于8个类群,以CFB(Cytophaga-Flexibacter-Bacterioides)类群和Proteobacteria类群的β-,γ-亚群为主.在7 cm左右深度的沉积物中,可培养微生物和16 S rDNA序列多样性与其他深度的沉积物有明显不同,推测与环境的变化有关.同时还发现了大量与降解有机化合物相关的细菌,表明阿德雷岛的微生物生态系统已经受到了人类活动的影响.

极端微生物产碱性蛋白酶菌株的筛选及发酵条件研究

从深海的 3 8份水样和泥样中筛选到一株产蛋白酶的菌株DY A ,其最适生长温度为1 0℃ ,能适应较大范围的pH值和盐度。此菌株只在酵母膏存在的情况下产酶 ,不利用单一氮源 ,最适产酶条件为 :pH1 0 0 ,1 0℃ ,接种量 0 5 % ,2 0 0r/min摇床培养 48～ 72h。粗酶液的最适作用温度为 40℃ ,最适pH值为 1 0 ,在pH9～ 1 2内稳定 ,是一碱性蛋白酶。

龙须菜寡糖分离纯化和抗食物过敏功效的研究

为探究深海细菌Flammeovirga pacifica降解龙须菜所产生的寡糖抗食物过敏功效,以龙须菜为原料,通过发酵、超滤、Superdex Peptide HR 10/300柱层析等方法获得高纯度寡糖.离子色谱结果显示:分离纯化获得的寡糖主要为四糖和六糖,其质量分数分别为48.47%和25.69%.小鼠过敏模型实验结果表明,腹腔注射该寡糖(100μg/只)能显著降低过敏小鼠血清特异性Ig E和Ig G1水平,提高特异性Ig G2a水平.通过灌胃(10 mg/只)能显著降低小鼠粪便中组胺的水平,且能有效缓解空肠组织过敏病理现象.小鼠脾淋巴细胞实验结果显示,该寡糖能在转录和转译水平上显著降低Th2细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)含量,促进Th1细胞因子IFN-γ分泌.说明该寡糖能有效调节辅助性T细胞的免疫功能向Th1细胞转换,从而抑制Th2细胞主导的食物过敏反应.

产冷适应复合酶菌株Pseudomonas sp.NJ197的选育、发酵条件及酶学性质

从南极普利兹湾深海沉积物中筛选到一株同时产多种冷适应酶的菌株NJ197，细菌学形态鉴定及16SrDNA序列分析表明，该菌株属于假单胞菌属（Pseudomonas）．生长特性研究表明，该菌株属于耐冷菌，其最适生长温度为5～15℃．NJ197菌株能利用多种单一的碳、氮源产酶，最适产酶温度为20℃，最高产酶温度为30℃．粗酶液经硫酸铵盐析、DEAE cellulose-52柱层析初步分离纯化后进行酶学性质的研究．该菌株所分泌复合酶中脂肪酶和淀粉酶的活力最高，它们的最适作用温度分别为30℃和35℃，最适pH值分别为9．0和9．5，对热敏感，是典型的碱性冷适应复合酶．Ca^2＋、Mn^2＋、Cu^2＋、Co^2＋、Fe^3＋对该复合酶有较为明显的激活作用，而Zn^2＋、Hg^2＋、Rb^2＋、Cd^2＋、EDTA则能抑制酶活．其中脂肪酶能在高浓度的SDS、CHAPS等变性剂中表现出较好的稳定性．

南极深海沉积物宏基因组DNA中低温脂肪酶基因的克隆、表达及性质分析

从南极普利兹湾深海900米深的沉积物中提取获得宏基因组DNA,并通过设计引物,从中克隆到全长为948bp的低温脂肪酶(lip3)开放阅读框完整序列,该基因编码一个由315个氨基酸残基组成、预计分子质量为34.557ku酶蛋白(Lip3);氨基酸序列上的GFGNS(GXGXS)和G-N-S-M-G(GXSXG)在许多脂肪酶中有很高的保守性,它们是水解机制所必需的序列,也是丝氨酸水解酶中最保守的序列.构建了lip3基因重组表达载体,并在大肠杆菌中获得表达,采用镍离子亲和层析柱对表达的酶蛋白Lip3进行纯化,得到约35ku蛋白条带,酶学性质的分析表明,该酶的最适作用温度为25℃,在0℃时表现为最高活力的22%,最适pH值为8.0,对热敏感,35℃热处理60min剩余酶活为10%,以硝基苯棕榈酸酯为底物,Lip3的酶促反应常数Km值随着反应温度的升高而升高,是典型的低温酶.

南极耐冷Pseudomonas sp.7323低温脂肪酶的性质及基因克隆

南极微生物是筛选低温酶的良好来源,但尚未得到充分的研究与开发.低温脂肪酶具有广阔的应用前景,其基因结构特征也具有重要的研究意义.本文对南极微生物开展了低温脂肪酶产生菌的筛选、基因克隆及特征分析.采用功能筛选的方法,从南极普里兹湾深海沉积物中获得一株产低温脂肪酶的菌株7323,其最适温度和最高生长温度分别为20℃和30℃,属于耐冷菌.16S rDNA序列分析表明,该菌属于假单胞菌属(Pseudomonas).通过设计引物扩增出的脂肪酶基因全长为1 854 bp,该基因编码一个由617氨基酸、分子量预计为64 466的蛋白质.氨基酸序列分析表明,该酶与Pseudomonassp.UB48的脂肪酶有89%的相似性,在催化区和C末端信号肽中存在高度保守的序列.纯化后的酶学性质研究表明,该脂肪酶的最适温度为35℃,最适pH值为9.0,为碱性低温酶.

固氮酶中N_2和N_2O结合位的一种新的鉴定方法

采用ＧＣ和ＧＣ－ＦＴＩＲ法，研究了Ｎ２和Ｎ２Ｏ对固氮酶催化Ｃ２Ｄ２还原活性及产物二氘代乙烯的反式－／顺式－异构体比值的影响，结果表明，Ｎ２和Ｎ２Ｏ均抑制Ｃ２Ｄ２的还原作用，并引起反式－／顺式－１，２－二氘代乙烯比值的增加．这一变化规律，与根据Ｃ２Ｈ２还原被Ｎ２和Ｎ２Ｏ抑制只发生在固氮酶铁钼辅基（ＦｅＭｏｃｏ）的笼内的假设而近似计算的结果相一致．实验结果和理论计算之间的一致性支持Ｎ２和Ｎ２Ｏ结合在ＦｅＭｏｃｏ的笼内。

南极土壤微生物宏基因组文库构建及其抗肿瘤活性初探

微生物代谢产物是药物的重要来源之一,然而采用传统的分离培养筛选的手段仅能对不到1％的微生物资源进行研究开发．通过构建环境样品微生物宏基因组文库能突破人工培养的瓶颈,直接克隆到完整的次级代谢产物合成基因簇,并从中寻找新的药物和活性次生代谢产物．实验直接提取南极中山站排污口土壤样品中微生物总基因组DNA,以黏粒(SuperCos 1)为载体,构建了宏基因组文库,获得了约27 000个克隆子,平均插入片段在35 kb以上,覆盖了至少946 Mb的微生物基因组信息．通过差异性DNA修复试验(DDRT)法对该文库进行筛选,获得13个具有抗肿瘤活性的克隆子,并采用MTT法对其中活性较高的克隆子进行细胞毒活性测定,表明克隆子AE-3对卵巢癌细胞具有明显的生长抑制作用．

产复合酶菌株Pseudomonas sp．NJ197产酶发酵条件的研究

从南极普利兹湾深海900m的沉积物中筛选到一株同时产多种低温复合酶的菌 株NJ197,作者对其进行碳源、氮源、无机盐、起始pH值、培养时间、接种量等发酵条 件的优化实验．实验结果证明,在以0．5％可溶性淀粉为碳源,以0．5％豆饼粉为氮 源,无机盐:0．424％NH4H2PO4、0．075％K2HPO4、0．02％MgSO4、0．5％CaCO3,起始 pH值8．5,接种36h种龄的种子10％,20℃、250r／min的条件下在旋转摇床中培养 72h,产复合酶菌株产脂肪酶和淀粉酶活性最高．最佳的生理条件下复合酶中的碱性 脂肪酶和淀粉酶的产量分别提高到22．4U／cm3和30．9U／cm3,该产复合酶菌株可以 作为诱变育种、基因工程菌改造的出发菌株,在洗涤和制革工业中有良好的应用前 景．

产酯酶海洋中度嗜盐菌Halomonas sp.LYG1-1的分离鉴定及其酶学性质

以从海南三亚近海海水中采集的样品为研究对象,利用平板筛选法筛到一株产酯酶的中度嗜盐菌菌株LYG1-1。通过形态学、生理生化及16S rRNA序列分析,发现该菌株为革兰氏阴性菌,其最适生长温度为30℃,最适生长pH为7.5,最适NaCl浓度为10%。16S rRNA基因序列分析显示,菌株LYG1-1与Halomonas salina亲缘性最近,16S rRNA基因序列相似性为99.72%。在含10%NaCl的0.05mol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中,45℃条件下作用,酶活性最高,40℃处理24h仍保持83%的活性。金属离子浓度为5mmol·L-1时,Ca2+、Mg2+对菌株LYG1-1酶活具有明显的激活作用,Hg2+表现出强烈的抑制作用。